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發(fā)布時(shí)間：2021-04-07 23:09 人氣： 來(lái)源：http://www.aozoc.com
一、病菌、黃曲霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)
１ 概述
病菌、黃曲霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)是檢驗(yàn)非要求殺菌中藥制劑及原、輔材受微生物菌種環(huán)境污染水平的方式。也是用以點(diǎn)評(píng)制造業(yè)企業(yè)的藥用價(jià)值原材料、輔材、機(jī)器設(shè)備、器材、生產(chǎn)流程、自然環(huán)境和作業(yè)者的衛(wèi)生條件的關(guān)鍵方式和根據(jù)。
病菌、黃曲霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)均選用平板菌落計(jì)數(shù)法，它是活菌記數(shù)的方式之一，也是現(xiàn)階段國(guó)際性上很多我國(guó)常見(jiàn)的一種方式。以在瓊脂平板上的病菌、黃曲霉菌和酵母產(chǎn)生一個(gè)單獨(dú)由此可見(jiàn)的菌落為記數(shù)根據(jù)。該測(cè)定方法結(jié)果只體現(xiàn)在該要求標(biāo)準(zhǔn)下所生長(zhǎng)發(fā)育的病菌（為一群嗜中溫、需氧和兼性厭氧菌）、黃曲霉菌和酵母的菌落數(shù)。不包括對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分、co2、溫度、pH和別的要素有特別要求的病菌、黃曲霉菌和酵母。
一個(gè)病菌、黃曲霉菌和酵母的菌落均可由一個(gè)或好幾個(gè)菌細(xì)胞生長(zhǎng)繁育而成。因而供試品中所測(cè)出的菌落數(shù)，具體為菌落產(chǎn)生企業(yè)數(shù)（colony forming unity，cfu），不可了解為病菌、黃曲霉菌、酵母的數(shù)量。
2 機(jī)器設(shè)備、儀器設(shè)備
2.1 機(jī)器設(shè)備
2.1.1 清潔試驗(yàn)室
微生物限度查驗(yàn)應(yīng)該有獨(dú)立的清潔試驗(yàn)室，每一個(gè)清潔試驗(yàn)室應(yīng)該有單獨(dú)的凈化室內(nèi)空氣系統(tǒng)軟件。
2.1.1.1 構(gòu)造和規(guī)定 清潔試驗(yàn)室應(yīng)光照優(yōu)良、防止?jié)窭?、避開(kāi)洗手間及污染。操作室與緩沖間中間應(yīng)該有試品傳送艙，進(jìn)出操作室和緩沖間的門(mén)不可直對(duì)。清潔試驗(yàn)室內(nèi)要六面光潔整平，能承受清理消毒殺菌。墻面與路面、吊頂天花板相接處應(yīng)呈凹弧型，無(wú)間隙，不留死角。操作室內(nèi)不可安裝下水管道。
清潔試驗(yàn)室內(nèi)的照明燈具應(yīng)嵌裝在吊頂天花板內(nèi)，房間內(nèi)陽(yáng)光照射應(yīng)遍布勻稱(chēng)，光照強(qiáng)度不少于300LX。
2.1.1.2 溫度、環(huán)境濕度 清潔試驗(yàn)室內(nèi)的溫度應(yīng)操縱在18～26℃，空氣濕度最好是在40％～60％。
2.1.1.3 操作室 操作室應(yīng)安裝空氣除菌過(guò)慮層.流設(shè)備。潔凈度等級(jí)不可小于10000級(jí)，部分潔凈度等級(jí)為100級(jí)（或置放同級(jí)別超凈工作臺(tái)）。操作室或超凈工作臺(tái)的清潔氣體應(yīng)維持對(duì)自然環(huán)境產(chǎn)生正壓力，不少于10Pa，操作室與緩沖間也應(yīng)維持相對(duì)性正壓力，不少于5Pa。實(shí)際操作臺(tái)子上常備藥品天平秤，酒精燈，火柴棍，酒精藥棉，大、小橡皮乳房等。
2.1.1.4 緩沖間 緩沖間內(nèi)要有洗臉盆和無(wú)菌檢測(cè)衣、帽、防護(hù)口罩、腳套等。
2.1.1.5 清潔等級(jí)及查驗(yàn)方式 一般 選用細(xì)顆粒物數(shù)及落菌數(shù)或沉降菌數(shù)測(cè)定方法（參考《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室》（區(qū)）飄浮顆粒、落菌、和沉降菌的測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)》的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)國(guó)家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)）開(kāi)展?jié)崈舳鹊燃?jí)認(rèn)證。
不一樣清潔等級(jí)的粒子、落菌和沉降菌規(guī)范見(jiàn)下表1。
表l 不一樣清潔等級(jí)的粒子、落菌和沉降菌規(guī)范
| 清潔等級(jí) |
浮塵數(shù)ㄍm3 |
落菌（個(gè)）ㄍm3 |
沉降菌（個(gè)）ㄍ （φ90mm?0.5h） |
|
| 粒子直徑≥0.5μm |
粒子直徑≥5μm |
|||
| 100級(jí) |
≤3，500 |
≤0 |
≤5 |
≤1 |
| 10000級(jí) |
≤350，000 |
≤2000 |
≤100 |
≤3 |
| 100000級(jí) |
≤3，500，000 |
≤20，000 |
≤500 |
≤10 |
沉降菌數(shù)測(cè)量（Ⅱ法）
清潔試驗(yàn)室工作臺(tái)消毒殺菌擦洗解決后，先運(yùn)行層流凈化設(shè)備30min，將備妥的營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂平板3個(gè)（經(jīng)30～35℃預(yù)培養(yǎng)48h，證實(shí)無(wú)菌落生長(zhǎng)發(fā)育）。以無(wú)菌檢測(cè)方法（或經(jīng)傳送箱）移人操作室，置凈化臺(tái)左、中、右各一個(gè)，打開(kāi)表蓋，曝露30min后將蓋上上。在30～35℃培養(yǎng)箱里顛倒培養(yǎng)48h，取下查驗(yàn)。3個(gè)平板生長(zhǎng)發(fā)育的均值菌落數(shù)不超過(guò)一個(gè)。
有標(biāo)準(zhǔn)的企業(yè)，另外應(yīng)查驗(yàn)清潔操作室和超凈工作臺(tái)上的落菌和粒子數(shù)。
實(shí)際操作問(wèn)和超凈工作臺(tái)要按時(shí)檢驗(yàn)其潔凈度等級(jí)，各自應(yīng)做到10000級(jí)和100級(jí)。如菌落數(shù)或粒子數(shù)超標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)清理過(guò)濾裝置中的過(guò)慮設(shè)備，必需時(shí)給予拆換。
2.1.1.6 在每一次操作之前、完用0.1％苯扎溴銨水溶液或別的適合消毒劑擦洗工作臺(tái)及很有可能環(huán)境污染的盲區(qū)，隨后運(yùn)行層流凈化設(shè)備。
2.1.2 陽(yáng)性菌試驗(yàn)室
涉及到試驗(yàn)室監(jiān)管菌種的分離出來(lái)評(píng)定、試品呈陽(yáng)性菌種的分離出來(lái)剖析、方式認(rèn)證實(shí)驗(yàn)中的陽(yáng)性菌實(shí)際操作等試驗(yàn)主題活動(dòng)，應(yīng)在專(zhuān)業(yè)的陽(yáng)性菌試驗(yàn)室開(kāi)展。除另有要求外，陽(yáng)性菌試驗(yàn)室應(yīng)符合我國(guó)Ⅱ級(jí)院內(nèi)感染規(guī)范，陽(yáng)性菌試驗(yàn)室應(yīng)配置生物安全柜。陽(yáng)性菌實(shí)際操作不可在供試品檢測(cè)用清潔試驗(yàn)室內(nèi)開(kāi)展。
2.1.3 清潔試驗(yàn)室、陽(yáng)性菌試驗(yàn)室與刷洗、殺菌、消毒殺菌、培養(yǎng)及結(jié)果觀(guān)查的工作中間等設(shè)備應(yīng)相對(duì)性集中化，合理布局，防止環(huán)境污染，方便管理。
2.2 儀器設(shè)備
2.2.1 控溫培養(yǎng)箱（30～35℃）、生物化學(xué)培養(yǎng)箱（23～28℃）、微波爐加熱、勻漿儀（3000～8000 r／min）或康氏震蕩器、恒溫水浴槽、電熱干燥箱（100～300℃）、家用冰箱、離心脫水機(jī)、離心管、微孔濾膜及薄膜過(guò)濾器、滅菌設(shè)備（應(yīng)用時(shí)要開(kāi)展殺菌實(shí)際效果查驗(yàn)并應(yīng)按時(shí)請(qǐng)相關(guān)部門(mén)計(jì)量檢定）。
菌落電子計(jì)數(shù)器、光學(xué)顯微鏡（40×～1500×）、電子分析天平或藥品天平秤（感量0.1g），pH計(jì)。
2.2.2 玻璃容器 錐形瓶（250～300ml、500毫升內(nèi)裝玻璃彈珠多個(gè)）、培養(yǎng)皿（9cm）、量筒（100ml，1000m1）、試管嬰兒（20mm×180mm）及塞、塑料吸管（1米一分度0.0l，十米一分度0.1）、注射針（20ml或30m1）、涂布棒、注射器頭、蓋玻片、蓋玻片、夾層玻璃消毒殺菌缸（有蓋）、不銹鋼湯桶（有蓋）。玻璃容器用前應(yīng)清洗整潔，塑料吸管、量筒不掛水珠，沒(méi)有殘留抑菌化學(xué)物質(zhì)。塑料吸管口上方距0.5厘米處塞進(jìn)約2cm的適合松散棉絮，置塑料吸管筒內(nèi)或牛皮紙包裝袋中。錐形瓶、量筒、試管嬰兒均需加棉塞或硅膠塞，若用震蕩器制取混懸液時(shí)，尚要用玻璃貼紙包囊瓶蓋，以防震蕩時(shí)供標(biāo)準(zhǔn)溶液環(huán)境污染瓶蓋，再用包裝紙捆扎。玻璃容器，均于160℃干熱滅菌1h或髙壓蒸汽121℃滅菌30min，烘干備用。
2.2.3 用品 大、小橡皮乳房（放于整潔有蓋的器皿中，并應(yīng)按時(shí)用70％～75％乙醇溶液泡浸）。無(wú)菌檢測(cè)衣、帽、防護(hù)口罩、膠手套（清洗后配套設(shè)施，用包裝紙包嚴(yán)）滅菌，備用。也可以用一次性無(wú)菌檢測(cè)衣、帽、防護(hù)口罩、膠手套。
接種環(huán)（白銥金或鎳鉻，環(huán)徑4～5毫米、長(zhǎng)短6～10厘米）、酒精燈、酒精藥棉或碘伏棉球、滅菌剪子或滅菌手術(shù)刀片和滅菌醫(yī)用鑷子、滅菌鋼錐、滅菌稱(chēng)樣紙、不銹鋼板藥匙、試管架、火柴棍、油性記號(hào)筆、白釉盤(pán)、洗臉盆、陶瓦蓋（12厘米）、試驗(yàn)記錄紙等。
3 標(biāo)準(zhǔn)溶液、油漆稀釋劑和實(shí)驗(yàn)試劑
3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液
3.1.1 0.1％苯扎溴銨水溶液或別的適合消毒劑（供洗手消毒、擦洗實(shí)際操作櫥柜臺(tái)面用）。
3.1.2 5％石碳酸水溶液（選好后裝進(jìn)夾層玻璃消毒殺菌主缸，供消毒殺菌細(xì)菌很多塑料吸管用）也可以采用別的適合消毒劑。
3.1.3 75％乙醇溶液。
3.1.4 碘酊或碘伏消毒液水溶液。
3.2 油漆稀釋劑和實(shí)驗(yàn)試劑
油漆稀釋劑配置后，選用髙壓蒸汽滅菌法滅菌。
3.2.1 0.9％無(wú)菌檢測(cè)氯化鈉溶液（配件二3.1）。
3.2.2 pH7.0無(wú)菌檢測(cè)氧化鈉?蛋白胨緩沖溶液（配件二3.5）。
3.2.3 無(wú)菌檢測(cè)聚山梨酯80氧化鈉?蛋白胨緩沖溶液（配件二3.4）。
3.2.4 pH6.8無(wú)菌檢測(cè)聚磷酸鹽緩沖溶液、pH7.6無(wú)菌檢測(cè)聚磷酸鹽緩沖溶液（配件二3.3）。
3.2.5 無(wú)菌檢測(cè)聚山梨酯80氯化鈉溶液（配件二3.2）。
3.2.6 無(wú)菌檢測(cè)0.1％鈦酸異丙酯三苯四氮唑水溶液（TTC）（配件二2.15）。
3.2.7 pH7.2無(wú)菌檢測(cè)聚磷酸鹽緩沖溶液（配件二3.3）。
4 培養(yǎng)液
4.1 營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂培養(yǎng)液（配件二5.2）。
4.2 玫紅鈉瓊脂培養(yǎng)液（配件二5.4）。
4.3 酵母菌浸取粉胨葡萄糖水（YPD）瓊脂培養(yǎng)液（配件二5.5）。
培養(yǎng)液制取常見(jiàn)問(wèn)題：
4.3.1 選用干躁培養(yǎng)液，按表明配置，解決滅菌后的培養(yǎng)液pH開(kāi)展校檢。若為自制培養(yǎng)液，原材料應(yīng)選擇，瓊脂凝結(jié)力應(yīng)測(cè)量，以明確配置時(shí)瓊脂使用量。實(shí)驗(yàn)試劑規(guī)格型號(hào)應(yīng)是化學(xué)純之上。
4.3.2 配置的培養(yǎng)液不應(yīng)該有沉積。若有沉積，應(yīng)于融化后趁熱過(guò)濾，滅菌后應(yīng)用。
4.3.3 培養(yǎng)液的散裝量不可超出器皿的2／3，以防滅菌時(shí)外溢。包裝時(shí)，瓶塞務(wù)必塞緊，以防松脫或掉下來(lái)導(dǎo)致染菌。
4.3.4 培養(yǎng)液配置后應(yīng)在1h內(nèi)滅菌，防止細(xì)菌繁殖。
4.3.5 滅菌后的培養(yǎng)液應(yīng)儲(chǔ)存在2～25℃，避免 被環(huán)境污染，可在3個(gè)星期內(nèi)用畢；儲(chǔ)存于密閉式器皿中，可在一年內(nèi)應(yīng)用。制取好的培養(yǎng)液置放時(shí)間不適合太長(zhǎng)，以防水份流失及染菌。
4.3.6 宜選用用水浴或微波爐熔融瓊脂培養(yǎng)液，勿用加熱爐立即熔融瓊脂培養(yǎng)液，以防營(yíng)養(yǎng)成分成分過(guò)多遇熱而毀壞。已熔融的培養(yǎng)液應(yīng)8h內(nèi)一次用完，剩下培養(yǎng)液不適合再用。
4.4 培養(yǎng)液適用范圍試驗(yàn)的規(guī)定及實(shí)際操作見(jiàn)本安全操作規(guī)程第三一部分。
5 供試品取樣、儲(chǔ)存及檢測(cè)量
5.1 取樣
5.1.1 一般選用簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣方式，其取樣量應(yīng)是檢測(cè)使用量（兩個(gè)之上最少包裝企業(yè)）的3～5倍量（以便考研復(fù)試或備用觀(guān)查）。
5.1.2 取樣時(shí)，凡發(fā)覺(jué)有出現(xiàn)異常或異常的試品，應(yīng)選擇有疑問(wèn)的試品。機(jī)械設(shè)備損害、顯著裂開(kāi)的包裝不可做為試品。
5.1.3 凡能從藥物、瓶塞（后蓋板里側(cè)及瓶塞周邊）外型看得出長(zhǎng)螨、長(zhǎng)霉、生蟲(chóng)及霉變的藥物，可立即判為特采，不用再品質(zhì)檢驗(yàn)。
5.2 儲(chǔ)存
5.2.1 供試品在檢測(cè)以前，應(yīng)儲(chǔ)存在蔭涼干躁處，勿冷凍或冷藏，防止供試品內(nèi)環(huán)境污染菌因儲(chǔ)存標(biāo)準(zhǔn)不當(dāng)之處至死，損害或繁育。
5.2.2 供試品在檢測(cè)以前，應(yīng)維持原包裝情況，禁止打開(kāi)。包裝已打開(kāi)的試品不可做為供試品開(kāi)展查驗(yàn)。
5.3 檢測(cè)量
5.3.1 全部制劑的檢測(cè)量均需源自?xún)蓚€(gè)之上包裝企業(yè)（中藥材蜜丸需源自4丸、膜劑取4片之上）。
5.3.2 固態(tài)及半固態(tài)（粘稠性供試品）中藥制劑檢測(cè)量為20g。
5.3.3 液態(tài)中藥制劑檢測(cè)量為10ml。
5.3.4 膜劑除另有要求外，檢測(cè)量為100cm2。
5.3.5 獨(dú)特珍貴或少量包裝的藥物，檢測(cè)量可酌減。除另有要求外，內(nèi)服固態(tài)中藥制劑不少于4g，液態(tài)中藥制劑選用源液者不可低于6ml，選用供標(biāo)準(zhǔn)溶液者不可低于3Ml，外敷藥物不可低于5G。
規(guī)定查驗(yàn)沙門(mén)氏菌的供試品，其檢測(cè)量應(yīng)提升40g或20ml（在其中20g或10ml用以陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)）。
6 實(shí)驗(yàn)提前準(zhǔn)備
6.1 將供樣品及全部已滅菌的平皿、錐形瓶、勻漿杯、試管嬰兒、塑料吸管（1ml、十米1）、量筒、油漆稀釋劑等挪到清潔試驗(yàn)室內(nèi)。每一次實(shí)驗(yàn)常用物件務(wù)必事前搞好方案，提前準(zhǔn)備充足使用量，防止實(shí)際操作中進(jìn)出清潔試驗(yàn)室。序號(hào)后將所有外包裝盒（包裝紙）除掉。
6.2 打開(kāi)清潔試驗(yàn)室氣體過(guò)濾系統(tǒng)，并使其工作中不少于30min。
6.3 實(shí)際操作工作人員用香皂或適合消毒液洗手，進(jìn)到緩沖間，換勞保鞋。再用0.1％苯扎溴銨水溶液或別的消毒液洗手或用酒精棉擦手，配戴無(wú)菌檢測(cè)衣、帽、防護(hù)口罩、膠手套。
6.4 操作之前先用酒精藥棉擦手，再用碘伏棉球（也可以用酒精藥棉）擦洗供試品瓶、盒、袋等的接口處周邊，待干后用滅菌的手術(shù)治療鑷或剪將供試品啟封。
7 供標(biāo)準(zhǔn)溶液的制取
依據(jù)供試品的物理化學(xué)特點(diǎn)與生長(zhǎng)習(xí)性，采用適合的方式制取供標(biāo)準(zhǔn)溶液。常用破乳劑，增稠劑、還原劑或消滅劑以及使用量應(yīng)證實(shí)是合理的，并對(duì)微生物菌種不含毒性。供標(biāo)準(zhǔn)溶液的制取若要用水浴加溫時(shí)，溫度不可超出45℃，時(shí)間不可超出30min。除另有要求外，常見(jiàn)的供試品制取方式以下：
7.1 液態(tài)供試品 取供樣品10ml，加pH7.0無(wú)菌檢測(cè)氧化鈉?蛋白胨緩沖溶液至100ml，攪拌，做為供標(biāo)準(zhǔn)溶液。除油劑可添加適量的無(wú)菌檢測(cè)聚山梨酯80使供樣品分散化勻稱(chēng)。水溶液態(tài)中藥制劑可以用混和的供試品源液做為供標(biāo)準(zhǔn)溶液。
7.2 固態(tài)、半固態(tài)或粘稠液供試品 取供樣品20g，加pH7.0無(wú)菌檢測(cè)氧化鈉?蛋白胨緩沖溶液至100ml，用勻漿儀或別的適合的方式，攪拌，做為供標(biāo)準(zhǔn)溶液。必需時(shí)加適當(dāng)?shù)臒o(wú)菌檢測(cè)聚山梨酯80，并置水浴中適度升溫使供樣品分散化勻稱(chēng)。
7.3 非水溶供試品
7.3.1 乳膏、乳膏藥 取供樣品5G（或5m1），加至含融化的（溫度不超過(guò)45℃）司盤(pán)805G、單聚醚甘油酯4g、聚山梨酯8010g的無(wú)菌檢測(cè)化合物（融化，溫度不超過(guò)45℃）的量杯中，即先將量杯中無(wú)菌檢測(cè)助有機(jī)溶劑化合物融化，待溫度不超過(guò)45℃時(shí)，添加供試品，用無(wú)菌檢測(cè)玻棒拌和結(jié)團(tuán)后，分次漸漸地添加45℃的pH7.0無(wú)菌檢測(cè)氧化鈉?蛋白胨緩沖溶液至100ml，邊加邊拌和，使供樣品充足乳狀液，做為1:20供標(biāo)準(zhǔn)溶液。
7.3.2 除油劑 取供樣品10ml，添加無(wú)菌檢測(cè)聚山梨酯80 5～8米l，混勻，再添加油漆稀釋劑至100ml，做為1:10供標(biāo)準(zhǔn)溶液。
7.3.3 栓劑 稱(chēng)量供試品20g，置滅菌錐形瓶中，加適當(dāng)油漆稀釋劑，置45℃水浴隔熱保溫10min，使溶，添加無(wú)菌檢測(cè)聚山梨酯80 5～8米l，振搖使之乳狀液，再加油漆稀釋劑（油漆稀釋劑和聚山梨酯80總產(chǎn)量為100m1），混勻，做為1:10供標(biāo)準(zhǔn)溶液。
7.3.4 膏藥 取供樣品20g，加至含20ml無(wú)菌檢測(cè)十四烷酸異丙酯（制作方法見(jiàn)附則ⅪH“無(wú)菌檢測(cè)檢測(cè)法”)和無(wú)菌檢測(cè)玻璃彈珠的適合器皿中，必需時(shí)可提升十四烷酸異丙酯的使用量，充足振搖，使供樣品融解。隨后添加45℃的pH7.0無(wú)菌檢測(cè)氧化鈉?蛋白胨緩沖溶液100m1，振搖5～10min，提純，待水油顯著分層次，取其隔水層做為1:10供標(biāo)準(zhǔn)溶液。
7.4 非水溶膜劑供試品 一般抽樣為100cm2，置滅菌錐形瓶中，添加適量的pH7.0無(wú)菌檢測(cè)氧化鈉?蛋白胨緩沖溶液，于45℃±1℃水浴中隔熱保溫，泡浸，振搖，以供試品浸液做為l:10供標(biāo)準(zhǔn)溶液。中藥材膜劑取100cm2，剪下來(lái)，加適當(dāng)?shù)膒H7.0無(wú)菌檢測(cè)氧化鈉?蛋白胨緩沖溶液（一般 1 cm2加1ml或1m1），泡浸，振搖，以供試品浸液做為1:10供標(biāo)準(zhǔn)溶液。
7．5 腸溶及乙狀結(jié)腸溶中藥制劑供試品 取供樣品20g，腸溶中藥制劑加pH6.8無(wú)菌檢測(cè)聚磷酸鹽緩沖溶液至100ml，乙狀結(jié)腸溶中藥制劑加pH7.6無(wú)菌檢測(cè)聚磷酸鹽緩沖溶液至100ml，均置45℃水浴中，振搖，使融解，做為1:10供標(biāo)準(zhǔn)溶液。
7.6 噴霧劑、噴霧供試品 取規(guī)定量供試品，置電冰箱冷凍室（－20℃下列）內(nèi)約1h。取下，快速消毒殺菌供試品器皿的打開(kāi)位置周邊，用無(wú)菌檢測(cè)鋼錐在器皿上鉆一小圓孔，在室內(nèi)溫度輕輕地旋轉(zhuǎn)器皿，使拋射劑慢慢所有釋放。用無(wú)菌檢測(cè)注射針吸出所有藥水，加至適當(dāng)?shù)挠推嵯♂寗ㄈ艉撬艹煞?，加適當(dāng)?shù)臒o(wú)菌檢測(cè)聚山梨酯80）中，攪拌，取等同于20g或10ml的供試品，再稀釋液成1:10的供標(biāo)準(zhǔn)溶液。
7.7 茶劑供試品 取供樣品20g，置滅菌錐形瓶中，添加油漆稀釋劑100ml，振搖2～3min，以滅菌沙布過(guò)慮（若為袋泡茶，可立即取2袋，以稱(chēng)樣結(jié)果按1:10加油漆稀釋劑，泡浸30min）。
之上供試品如吸濕澎漲，或粘度過(guò)高，可提升油漆稀釋劑的量，做成1:20～1:100供標(biāo)準(zhǔn)溶液。
7.8 貼膏藥供試品 取規(guī)定量供試品，除掉膏藥的防護(hù)層，置放在無(wú)菌檢測(cè)夾層玻璃或塑料板上，黏貼臉朝上。用適合的無(wú)菌檢測(cè)多孔結(jié)構(gòu)（如無(wú)菌紗布）遮蓋膏藥的黏貼面以防止膏藥黏貼在一起。隨后將其放置適合容積并帶有消滅劑（如聚山梨酯80或大豆卵磷脂）的油漆稀釋劑中，用勁震蕩最少30min，或置放于勻質(zhì)儀勻質(zhì)l0min，或以別的方式制取成供標(biāo)準(zhǔn)溶液。
7.9 具抗菌特異性的供試品
當(dāng)供試品具備抗菌特異性時(shí)，應(yīng)清除供標(biāo)準(zhǔn)溶液的抗菌特異性后，再依規(guī)查驗(yàn)。常見(jiàn)的方式以下：
7.9.1 稀釋液法 取規(guī)定量的供標(biāo)準(zhǔn)溶液，加至較很多的培養(yǎng)液中，使企業(yè)容積內(nèi)的供試品成分降低至沒(méi)有殺菌作用。用平板電腦測(cè)定方法菌數(shù)時(shí)，1ml供標(biāo)準(zhǔn)溶液可相等分注好幾個(gè)平皿；操縱菌查驗(yàn)時(shí)，可增加增菌培養(yǎng)液的使用量。培養(yǎng)液稀釋液法適用殺菌作用較弱的中藥制劑。
7.9.2 抽濾離子交換法 此方式用以除去供標(biāo)準(zhǔn)溶液中的沉淀，針對(duì)抗菌特異性極強(qiáng)的供試品，如供標(biāo)準(zhǔn)溶液中有不溶顆粒物、沉積，取供標(biāo)準(zhǔn)溶液，先以500 r／min，抽濾3min，取上清液開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，此方式用以病菌記數(shù)和操縱菌（病菌）查驗(yàn)。
7.9.3 塑料薄膜過(guò)濾法 見(jiàn)細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)。
7.9.4 中合法 凡含汞、砷或添加劑的供試品，可以用相對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)試劑鈍化處理、中合其抗菌特異性，做成供標(biāo)準(zhǔn)溶液。
8 供標(biāo)準(zhǔn)溶液的釋?。?0倍增長(zhǎng)稀釋液法）
8.1 取2～3支殺菌試管嬰兒，各自添加8ml pH7.0氧化鈉－蛋白胨緩沖溶液殺菌油漆稀釋劑（這時(shí)實(shí)際操作一般為：右手執(zhí)試管嬰兒并將塞開(kāi)啟，歪斜，左手執(zhí)10ml塑料吸管吸量。切忌在酒精噴燈火苗的上方實(shí)際操作，以防火苗將供標(biāo)準(zhǔn)溶液中的菌體細(xì)胞消滅）。加油漆稀釋劑后，試管嬰兒塞應(yīng)該馬上塞外。
8.2 另取1支1ml殺菌塑料吸管吸1:10勻稱(chēng)供標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml，添加配有8ml pH7.0氧化鈉－蛋白胨緩沖溶液殺菌油漆稀釋劑的試管嬰兒中，攪拌，即得1:100供標(biāo)準(zhǔn)溶液。依此類(lèi)推，依據(jù)供試品環(huán)境污染水平，可稀釋液至1:103、1:104等適合稀釋液級(jí)。每增長(zhǎng)l稀釋液級(jí)，務(wù)必另?yè)Q一支塑料吸管。
稀釋液時(shí)，塑料吸管插進(jìn)第1級(jí)封閉液內(nèi)不少于液位2.5厘米，不斷吸吹約10次。吸液管時(shí)，應(yīng)多吸至高過(guò)塑料吸管上端標(biāo)尺少量，隨后提到塑料吸管，貼到試管嬰兒內(nèi)腔調(diào)節(jié)水率至標(biāo)尺，塑料吸管挪到第二級(jí)稀釋液管的內(nèi)腔近液位處（勿觸碰液位）遲緩地釋放所有供標(biāo)準(zhǔn)溶液（塑料吸管內(nèi)要無(wú)粘附或殘余液態(tài)），隨后將塑料吸管放進(jìn)消毒劑主缸。
9 記數(shù)方式認(rèn)證
因?yàn)橐恍┕┰嚻肪邆湟志禺愋裕趧?chuàng)建測(cè)定法或原測(cè)定方法的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)生改變時(shí)，很有可能危害檢測(cè)結(jié)果的精確性，務(wù)必對(duì)供樣品的抗菌特異性及測(cè)定法的穩(wěn)定性開(kāi)展認(rèn)證。對(duì)各實(shí)驗(yàn)菌的利用率應(yīng)逐一開(kāi)展認(rèn)證。
9.1 認(rèn)證用菌種大腸埃希菌Escherichia coli[CMCC(B) 44102]，橙黃色鏈球菌Staphylococcus aureus[CCMCC(B) 26003]，枯草枯草芽孢菌Bacillus subtilis[CMCC(B) 63501]，白色念珠菌Candida albicans[CMCC(F) 98001]，黑曲霉菌Aspergillus niger[CMCC(F) 98003]。
菌液制取 打疫苗大腸埃希菌、橙黃色鏈球菌、枯草枯草芽孢菌的新鮮塑造物至營(yíng)養(yǎng)成分骨頭湯培養(yǎng)液中或營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂培養(yǎng)液上，塑造18～24小時(shí)；打疫苗白色念珠菌的新鮮塑造物至改進(jìn)喬治培養(yǎng)液中或改進(jìn)喬治瓊脂培養(yǎng)液上，塑造24～48h。以上塑造物用0.9％無(wú)菌檢測(cè)氯化鈉溶液做成每1ml含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液。打疫苗黑曲霉的新鮮塑造物至改進(jìn)喬治瓊脂斜坡培養(yǎng)液上，塑造5～7天，添加3～5ml含0.05％（ml／m1）聚山梨酯80的0.9％無(wú)菌檢測(cè)氯化鈉溶液，將胞子過(guò)柱。隨后，用適合方式吸出胞子懸液至無(wú)菌檢測(cè)試管嬰兒內(nèi)，用含0.05％（ml／ml）聚山梨酯80的0.9％無(wú)菌檢測(cè)氯化鈉溶液做成每1ml含胞子數(shù)50～l00cfu的胞子懸液。
菌懸液制取后，若在室內(nèi)溫度下置放應(yīng)在1h內(nèi)應(yīng)用，若儲(chǔ)存在2～8℃的菌懸液能夠 在24小時(shí)內(nèi)應(yīng)用。黑曲霉菌的胞子懸液儲(chǔ)存在2～8℃，可在認(rèn)證過(guò)的儲(chǔ)存期內(nèi)取代相匹配量的新鮮胞子懸液應(yīng)用。
9.2 認(rèn)證方式 認(rèn)證實(shí)驗(yàn)分4組，最少應(yīng)開(kāi)展3次單獨(dú)的平行面實(shí)驗(yàn)，并各自測(cè)算供試品組和對(duì)照實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)的菌利用率。
9.2.1 供試品組 取最少稀釋液級(jí)的供標(biāo)準(zhǔn)溶液，按每1ml供標(biāo)準(zhǔn)溶液添加50～l00cfu實(shí)驗(yàn)菌，按菌落計(jì)數(shù)方式測(cè)量其菌數(shù)。平皿法記數(shù)時(shí)，取實(shí)驗(yàn)菌液、供標(biāo)準(zhǔn)溶液各1ml各自引入平皿中，馬上竭盡瓊脂培養(yǎng)液；塑料薄膜過(guò)濾法記數(shù)時(shí)，取供標(biāo)準(zhǔn)溶液2ml過(guò)慮，清洗液清洗，并在最后一次的清洗液中添加實(shí)驗(yàn)菌。
9.2.2 活菌組 取以上實(shí)驗(yàn)菌液，測(cè)量其添加的實(shí)驗(yàn)菌菌數(shù)。
9.2.3 供試品對(duì)照實(shí)驗(yàn) 取最少稀釋液級(jí)的供標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml，按菌落計(jì)數(shù)方式測(cè)量供試品本底菌數(shù)。
9.2.4 油漆稀釋劑對(duì)照實(shí)驗(yàn) 為調(diào)查供標(biāo)準(zhǔn)溶液制取全過(guò)程中對(duì)微生物菌種危害的水平，可以用相對(duì)應(yīng)的封閉液取代供試品，添加實(shí)驗(yàn)菌，使最后菌濃度值為每1ml含50～l00cfu，按供試品組的供標(biāo)準(zhǔn)溶液制取方式和菌落計(jì)數(shù)方式測(cè)量其菌數(shù)。
9.3 結(jié)果判斷對(duì)照實(shí)驗(yàn)的菌利用率均應(yīng)不少于70％。若供試品組的菌利用率均不少于70％，則可按該供標(biāo)準(zhǔn)溶液制取方式和菌落計(jì)數(shù)測(cè)定方法供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母數(shù)；若任一次實(shí)驗(yàn)中供試品組的菌利用率小于70％，應(yīng)創(chuàng)建新的方式，清除供試品的抗菌特異性，并再次認(rèn)證。
9.4 認(rèn)證實(shí)驗(yàn)可與供試品的細(xì)菌，霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)另外開(kāi)展。
9.5 常見(jiàn)問(wèn)題
9.5.1 常用規(guī)范菌苗的傳代頻次不可超出5代。以低溫干燥的初始菌苗打開(kāi)后轉(zhuǎn)種塑造，其塑造物為第一代。
9.5.2 黑曲霉菌的菌液制取 將黑曲霉菌打疫苗至改進(jìn)喬治瓊脂斜坡培養(yǎng)液上，于20～25℃塑造5～7天，使很多的胞子造成。添加3～5ml含0.05％（ml／m1）聚山梨酯80的0.9％無(wú)菌檢測(cè)氯化鈉溶液，用無(wú)菌檢測(cè)玻棒或接種環(huán)輕輕地將胞子過(guò)柱。隨后可以用一支l0ml無(wú)菌檢測(cè)球型孔狀塑料吸管，其支管用無(wú)菌檢測(cè)棉絮或沙布捆扎且能過(guò)慮真菌的設(shè)備，吸出胞子懸液至無(wú)菌檢測(cè)試管嬰兒內(nèi)，將胞子懸液稀釋液至1ml含50～l00cfu。
9.5.3 做實(shí)驗(yàn)菌的利用率實(shí)驗(yàn)時(shí)，添加菌量50～l00cfu為宜。加菌量太多，如塑料薄膜法，菌體擁堵，則不太好記數(shù)；加菌量偏少，則差值很大。
9.5.4 開(kāi)展認(rèn)證實(shí)驗(yàn)時(shí)，若因沒(méi)有適合的方式清除供試品中的殺菌作用而造成微生物菌種收購(gòu) 的不成功，應(yīng)選用能使微生物菌種生長(zhǎng)發(fā)育的高些稀釋液級(jí)供標(biāo)準(zhǔn)溶液開(kāi)展方式認(rèn)證實(shí)驗(yàn)。這時(shí)高些稀釋液級(jí)供標(biāo)準(zhǔn)溶液的確定要從低往高的稀釋液級(jí)開(kāi)展，但最大稀釋液級(jí)供標(biāo)準(zhǔn)溶液挑選應(yīng)依據(jù)供試品應(yīng)合乎的微生物限度規(guī)范和菌數(shù)匯報(bào)標(biāo)準(zhǔn)，如供試品應(yīng)合乎的微生物限度規(guī)范是1克細(xì)菌數(shù)不可過(guò)1000cfu，那麼最大稀釋液級(jí)是1:10?3。
若選用容許的最大稀釋液級(jí)供標(biāo)準(zhǔn)溶液開(kāi)展認(rèn)證實(shí)驗(yàn)還存有一株或多枝實(shí)驗(yàn)菌的利用率達(dá)不上規(guī)定，那麼應(yīng)挑選收購(gòu) 狀況最貼近規(guī)定的方式開(kāi)展供試品的檢驗(yàn)。如某類(lèi)商品對(duì)某實(shí)驗(yàn)菌有極強(qiáng)的抗菌特性，選用塑料薄膜過(guò)濾法的利用率為40％，而選用培養(yǎng)液稀釋液法的利用率為30％，那麼應(yīng)挑選塑料薄膜過(guò)濾法開(kāi)展該供樣品的檢驗(yàn)。在這里狀況下，生產(chǎn)制造企業(yè)或研發(fā)企業(yè)應(yīng)依據(jù)原輔材料的微生物菌種品質(zhì)、生產(chǎn)工藝流程及產(chǎn)品特性開(kāi)展商品的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，以確保檢測(cè)方式的穩(wěn)定性，進(jìn)而確保產(chǎn)品品質(zhì)。
10 檢測(cè)法
10.1 平皿法
10.1.1 在以上開(kāi)展10倍增長(zhǎng)稀釋液的另外，以該稀釋液級(jí)塑料吸管，汲取該稀釋液級(jí)供標(biāo)準(zhǔn)溶液各1ml至每一個(gè)直徑90mm的殺菌平皿中，或從高稀釋液級(jí)至低稀釋液級(jí)吸液管時(shí)可以用1支塑料吸管吸供標(biāo)準(zhǔn)溶液各1ml至每一個(gè)殺菌平皿中。每一稀釋液級(jí)每個(gè)培養(yǎng)液最少注2～3個(gè)平皿（一般為右手執(zhí)平皿，將蓋半閉，左手執(zhí)塑料吸管），注皿時(shí)，將1ml供標(biāo)準(zhǔn)溶液漸漸地所有引入平皿中，管中沒(méi)有殘留液態(tài)，避免 返流到塑料吸管頂尖部。
10.1.2 陰性對(duì)照 待各個(gè)封閉液注皿結(jié)束后，用1支1ml塑料吸管汲取實(shí)驗(yàn)用油漆稀釋劑（pH7.0氧化鈉－蛋白胨緩沖溶液）各1ml，各自引入4個(gè)平皿中。在其中兩個(gè)作細(xì)菌數(shù)陰性對(duì)照；另兩個(gè)作霉菌、酵母數(shù)陰性對(duì)照，如另用YPD瓊脂測(cè)量酵母數(shù)時(shí)，則再提升兩個(gè)平皿作酵母數(shù)陰性對(duì)照。
10.1.3 竭盡培養(yǎng)液
將事先配置好的細(xì)菌記數(shù)用的營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂培養(yǎng)液；霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)用的玫紅鈉瓊脂培養(yǎng)液；含純蜂蜜、王漿液態(tài)中藥制劑用玫紅鈉瓊脂培養(yǎng)液（霉菌）和YPD瓊脂培養(yǎng)液（酵母）熔融，冷至約45℃時(shí)，竭盡以上每個(gè)平皿約15ml，以順時(shí)針?lè)较蚧蚍疵脶樂(lè)轿谎杆俎D(zhuǎn)動(dòng)平皿，使供標(biāo)準(zhǔn)溶液或封閉液與培養(yǎng)液攪拌，蓋上陶瓦蓋，或半蓋上，去除凝結(jié)水后，再移去陶瓦蓋后，蓋上平皿蓋置實(shí)際操作服務(wù)平臺(tái)上待凝。在轉(zhuǎn)動(dòng)平皿時(shí)切忌將培養(yǎng)液濺到皿邊及皿蓋上。
10.1.4 塑造
細(xì)菌記數(shù)平板電腦倒放置30～35℃恒溫箱中塑造三天。霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)平板電腦倒放置23～28℃恒溫箱中塑造5天，必需時(shí)增加至7天。逐日觀(guān)查菌體生長(zhǎng)發(fā)育狀況，點(diǎn)計(jì)菌體數(shù)。
10.1.5 菌落計(jì)數(shù)
10.1.5.1 一般將平板電腦置菌落計(jì)數(shù)器上或從平板電腦的反面立即以人眼點(diǎn)計(jì)，以散射光襯以深色情況，認(rèn)真觀(guān)察。勿漏計(jì)細(xì)微的瓊脂層內(nèi)友誼皿邊沿生長(zhǎng)發(fā)育的菌體。留意細(xì)菌菌體、霉菌菌體和酵母菌體中間，及其菌體與供試品顆粒物、培養(yǎng)液沉淀、汽泡、液滴等的差別。必需時(shí)要高倍放大鏡或用高倍光學(xué)顯微鏡立即觀(guān)查，或挑取異常物玻片鏡檢查。
10.1.5.2 供試品如為微生物菌種中藥制劑，應(yīng)將合理微生物菌種菌體清除，不能點(diǎn)計(jì)在細(xì)菌、霉菌和酵母數(shù)內(nèi)。清除的方式需按該中藥制劑微生物菌種種類(lèi)而定，并須觀(guān)查菌體特點(diǎn)及上色形狀。
10.1.5.3 供試品封閉液常帶有不可溶原材料、輔材，培養(yǎng)液注皿后亦很有可能造成沉淀，歷經(jīng)塑造后有時(shí)候產(chǎn)生總數(shù)許多 的有形化物，且難與菌體相差別。為了更好地有益于菌落計(jì)數(shù)，可在實(shí)際操作時(shí)將適合稀釋液級(jí)的供標(biāo)準(zhǔn)溶液多提升注皿（1～兩個(gè)平皿）。注皿后不經(jīng)過(guò)塑造而置放于電冰箱（勿結(jié)冰）中。在記數(shù)菌體時(shí)做為對(duì)比?；蛴煤琓TC營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂注皿，經(jīng)塑造后該培養(yǎng)液生長(zhǎng)發(fā)育的菌體為鮮紅色，襯于白背景上便于點(diǎn)計(jì)細(xì)菌菌體和區(qū)別別的有形化物。有一些乳膏等非水溶供試品，經(jīng)營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂注皿后呈奶白色，塑造后生長(zhǎng)發(fā)育的菌體不容易分辨和點(diǎn)計(jì)，為避免 這類(lèi)狀況，也可以用含TTC營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂注皿。TTC的使用量要以不抑止微生物菌種生長(zhǎng)發(fā)育為宜，一般 應(yīng)用的濃度值為0.001％。
10.1.5.4 若平板電腦上面有兩個(gè)或兩個(gè)之上菌體重合，人眼可鑒別時(shí)仍以?xún)蓚€(gè)或兩個(gè)之上菌落計(jì)數(shù)；若平板電腦生長(zhǎng)發(fā)育有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)或塊狀、云霧繚繞狀菌體，菌體間無(wú)顯著界限，一條鏈、片做為一個(gè)菌體計(jì)，但若鏈、上面發(fā)生特性與鏈、塊狀菌體不一樣的分得清菌體時(shí)，仍應(yīng)各自記數(shù)，若生長(zhǎng)發(fā)育擴(kuò)散的很大的塊狀菌體或斑點(diǎn)樣菌體，其邊緣有多個(gè)特性類(lèi)似的單獨(dú)菌體，一般不適合做為記數(shù)用。
10.1.5.5 菌體生長(zhǎng)發(fā)育呈擴(kuò)散發(fā)展趨勢(shì)者，細(xì)菌需要在24小時(shí)，霉菌需要在48h做基本點(diǎn)計(jì)（點(diǎn)計(jì)霉菌菌體時(shí)，輕輕地旋轉(zhuǎn)平板電腦，勿不斷旋轉(zhuǎn)，不然使初期產(chǎn)生的胞子撒落在平板電腦的別的位置，又萌發(fā)新的霉菌菌體，造成記數(shù)差值）。
10.1.5.6 在塑造三天點(diǎn)計(jì)細(xì)菌，塑造5天點(diǎn)計(jì)霉菌時(shí)，如菌體很小，不容易分辨，細(xì)菌記數(shù)能延長(zhǎng)塑造時(shí)間至5天；霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)能延長(zhǎng)塑造時(shí)間至7天，再點(diǎn)計(jì)菌體數(shù)。
10.1.5.7 對(duì)有質(zhì)疑的供試品以YPD培養(yǎng)液作酵母菌計(jì)數(shù)時(shí)，可塑造至1周再點(diǎn)計(jì)菌體數(shù)。
10.1.5.8 含純蜂蜜、王漿液態(tài)中藥制劑用玫紅鈉瓊脂培養(yǎng)液點(diǎn)計(jì)霉菌數(shù)，YPD瓊脂培養(yǎng)液點(diǎn)計(jì)酵母數(shù)。二者合拼記數(shù)。
10.1.5.9 在特殊情況下，若營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂培養(yǎng)液上起有霉菌和酵母、玫紅鈉瓊脂培養(yǎng)液上起有細(xì)菌，則應(yīng)各自點(diǎn)計(jì)霉菌和酵母、細(xì)菌菌體數(shù)。隨后將營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂培養(yǎng)液上的霉菌和酵母數(shù)或玫紅鈉瓊脂培養(yǎng)液上的細(xì)菌數(shù)，與玫紅鈉瓊脂培養(yǎng)液中的霉菌和酵母數(shù)或營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂培養(yǎng)液中的細(xì)菌數(shù)開(kāi)展較為，以菌體數(shù)大的培養(yǎng)液中的菌數(shù)為記數(shù)結(jié)果。
10.1.6 菌數(shù)匯報(bào)標(biāo)準(zhǔn)
10.1.6.1 宜選擇細(xì)菌、酵母均值菌體數(shù)低于300cfu、霉菌菌體數(shù)平均值低于100cfu的平板電腦記數(shù)做為菌數(shù)匯報(bào)（取倆位有效數(shù)字）的根據(jù)。
10.1.6.2 當(dāng)僅有一個(gè)稀釋液級(jí)的菌體數(shù)合乎以上要求，以該級(jí)的均值菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告菌數(shù)；當(dāng)有2個(gè)或2個(gè)之上油漆稀釋劑的菌落數(shù)合乎以上要求，以最大的均值菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)值的值報(bào)告。
10.1.6.3 如各稀釋液級(jí)的平板電腦均無(wú)菌落生長(zhǎng)發(fā)育，或僅最少稀釋液級(jí)的平板電腦有菌落生長(zhǎng)發(fā)育，但均值茵落數(shù)低于1時(shí)，以低于1乘以最少稀釋倍數(shù)報(bào)告菌數(shù)。
菌數(shù)報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)實(shí)例見(jiàn)下表2。
表2 菌數(shù)報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)實(shí)例
| 菌數(shù)報(bào)告 標(biāo)準(zhǔn)實(shí)例 |
各稀釋液級(jí)（供標(biāo)準(zhǔn)溶液1mlㄍ皿）均值菌落記數(shù)（cfu） |
菌數(shù)報(bào)告數(shù) （cfuㄍg，ml，10cm2） |
|||
| 源液 |
1:10（－1） |
1:102（－2） |
1:103（－3） |
||
| 1 |
―― |
64 |
8 |
2 |
640 |
| 2 |
―― |
420 |
64 |
8 |
6400 |
| 3 |
―― |
不能計(jì) |
420 |
64 |
64000 |
| 4 |
―― |
0 |
0.5 |
0 |
＜100 |
| 5 |
―― |
―― |
0 |
0 |
＜100 |
| 6 |
―― |
0 |
0 |
0 |
＜10 |
| 7 |
0 |
0 |
0 |
―― |
＜1 |
10.2 塑料薄膜過(guò)濾法
10.2.1 塑料薄膜過(guò)濾法關(guān)鍵具有聚集微生物菌種、分離出來(lái)除去試品中對(duì)微生物菌種生長(zhǎng)發(fā)育造成影響的要素的功效，能夠 合理提升 查驗(yàn)結(jié)果的敏感度和穩(wěn)定性，是近些年微生物菌種查驗(yàn)行業(yè)中日益廣泛運(yùn)用的一種方式方法。
10.2.2 塑料薄膜過(guò)濾法選用的濾膜孔徑應(yīng)不超0.45um。濾紙直徑一般為50毫米，為以便記數(shù)，及其緩解供標(biāo)準(zhǔn)溶液阻塞濾紙的狀況，在以便實(shí)際操作的前提條件下，能夠 采用直徑更高的濾紙或薄膜過(guò)濾器。選用不一樣直徑的濾紙，清洗量應(yīng)開(kāi)展相對(duì)應(yīng)的調(diào)節(jié)。挑選濾紙材料時(shí)要確保供試品以及有機(jī)溶劑不危害微生物菌種的充足被截流。過(guò)濾裝置及濾紙應(yīng)用前要選用適合的方式殺菌。應(yīng)用時(shí)，應(yīng)確保濾紙?jiān)谶^(guò)慮前后左右的一致性。
10.2.3 水溶供標(biāo)準(zhǔn)溶液過(guò)慮前先將小量的清洗液過(guò)慮以濕潤(rùn)濾紙。原料油供試品，其濾紙和過(guò)濾裝置在應(yīng)用前要充足干躁。為充分發(fā)揮濾紙的較大 過(guò)濾效率，應(yīng)留意維持供試品水溶液及清洗液遮蓋全部濾紙表層。供標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)塑料薄膜過(guò)慮后，若必須用清洗液清洗濾紙，以濾紙直徑為50毫米的濾紙計(jì)，每一張濾紙每一次清洗量不超過(guò)100ml，總清洗量不可超出100ml；別的直徑的濾紙及薄膜過(guò)濾器可按膜總面積占比調(diào)節(jié)，總的標(biāo)準(zhǔn)是防止大容積、過(guò)高水流量的清洗導(dǎo)致濾紙上的微生物菌種受損害。
10.2.4 因?yàn)楣?biāo)準(zhǔn)溶液中一些不可以根據(jù)濾紙的顆粒物存有，經(jīng)常導(dǎo)致濾紙阻塞、工作壓力上升，比較嚴(yán)重狀況時(shí)很有可能產(chǎn)生過(guò)濾系統(tǒng)爆裂導(dǎo)致安全生產(chǎn)事故或試驗(yàn)室環(huán)境污染；也很有可能產(chǎn)生因?yàn)楣ぷ鲏毫^(guò)大濾紙裂開(kāi)或?yàn)V膜孔徑增大，導(dǎo)致濾紙對(duì)微生物菌種的過(guò)慮截流不成功。因此，操作過(guò)程中應(yīng)考慮到對(duì)塑料薄膜過(guò)慮中的工作壓力操縱和機(jī)器設(shè)備的安全系數(shù)，設(shè)定一定的安全性工作壓力程度，比如濾紙兩邊壓力差不可過(guò)50psi。實(shí)際工作壓力程度應(yīng)依據(jù)實(shí)際塑料薄膜過(guò)濾系統(tǒng)及濾紙明確。
10.2.5 選用適度方式除去供標(biāo)準(zhǔn)溶液中的顆粒物（前提條件是不可以危害微生物菌種的利用率）、適度提升塑料薄膜總面積或減少過(guò)慮液態(tài)水流量能夠 合理減少濾紙兩邊的壓差。
10.2.6 取等同于每一張濾紙含1g、1ml或10cm2供試品的供標(biāo)準(zhǔn)溶液，加至適當(dāng)?shù)挠推嵯♂寗┲?，攪拌，過(guò)慮。若供試品每1g、1ml或10cm2含有的菌數(shù)較多時(shí)，可用適合稀釋液級(jí)的供標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml，過(guò)慮。用pH7.0無(wú)菌檢測(cè)氧化鈉－蛋白胨緩沖溶液或別的適合的清洗液清洗濾紙，清洗方式和清洗量見(jiàn)10.2.3及10.2.4。清洗后取下濾紙，菌臉朝上貼到營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂培養(yǎng)液或玫紅鈉瓊脂培養(yǎng)液或酵母菌浸取粉胨葡萄糖水瓊脂培養(yǎng)液平板電腦上塑造。每個(gè)培養(yǎng)液最少制取一張濾紙。濾紙貼到平板電腦處時(shí)不可有間隙或汽泡，不然危害微生物菌種生長(zhǎng)發(fā)育。
10.2.7 貼膏藥宜選用塑料薄膜過(guò)濾法開(kāi)展病菌、黃曲霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)。
10.2.8 陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn) 取實(shí)驗(yàn)用的封閉液1ml照以上塑料薄膜過(guò)濾法實(shí)際操作，做為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照不可有菌生長(zhǎng)發(fā)育。
10.2.9 塑造和記數(shù) 塑造標(biāo)準(zhǔn)和記數(shù)方式同平皿法，一片濾紙上的菌落數(shù)應(yīng)不超過(guò)100cfu。
10.2.10 菌數(shù)報(bào)告標(biāo)準(zhǔn) 以等同于1g、1ml或10cm2供試品的菌落數(shù)報(bào)告菌數(shù)；若濾紙上無(wú)菌落生長(zhǎng)發(fā)育，以＜1報(bào)告菌數(shù)（每一張濾紙過(guò)慮1g、1ml或10cm2供試品），或＜1乘以最少稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。
10.3 培養(yǎng)液稀釋液法
取低稀釋液級(jí)供標(biāo)準(zhǔn)溶液（源液或1:10供標(biāo)準(zhǔn)溶液或別的供標(biāo)準(zhǔn)溶液）2份，每一份各1ml，各自引入平皿中（每皿0.5ml、0.2ml或＜0.1m1），每一個(gè)平皿竭盡營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂培養(yǎng)液約15ml，攪拌，凝結(jié)后，顛倒塑造，記數(shù)。
每一份供標(biāo)準(zhǔn)溶液所充注平板電腦點(diǎn)計(jì)的菌落之和，即是每lml菌落數(shù)，共得2組數(shù)據(jù)信息。以2份低稀釋液級(jí)供標(biāo)準(zhǔn)溶液菌落數(shù)的均值乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。
10.4 結(jié)果報(bào)告
10.4.1 菌落數(shù)在100以?xún)?nèi)時(shí)，按登記數(shù)據(jù)信息報(bào)告。
10.4.2 菌落數(shù)超過(guò)100時(shí)，取倆位有效數(shù)字報(bào)告，第三位按數(shù)據(jù)修約規(guī)則解決。
10.5 考研復(fù)試
供試品細(xì)菌數(shù)、黃曲霉菌及酵母菌菌數(shù)在其中任一項(xiàng)一次檢測(cè)不過(guò)關(guān)，需從同一批試品中任意再次取2倍包裝量的供試品，依規(guī)作單項(xiàng)工程考研復(fù)試2次，以三次檢測(cè)結(jié)果的平均值報(bào)告。若3次結(jié)果的均值超出該種類(lèi)項(xiàng)下的要求，判供樣品不符合要求；不然，判供樣品符合要求。
10.6 常見(jiàn)問(wèn)題
10.6.1 菌落記數(shù)測(cè)量每計(jì)數(shù)單位（每皿或每膜）的適宜記數(shù)范疇不適合過(guò)低，一般 每計(jì)數(shù)單位不可低于25cfu，小于這一程度越多差值越大，故應(yīng)依據(jù)具體微生物限度規(guī)范和環(huán)境污染水平明確適合的供標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋液等比級(jí)數(shù)和記數(shù)測(cè)定法。當(dāng)規(guī)范程度過(guò)低或由于實(shí)際操作必須供試品稀釋液水平過(guò)高，能夠 取很大容積供標(biāo)準(zhǔn)溶液根據(jù)塑料薄膜過(guò)濾法聚集記數(shù)測(cè)量。不一樣程度規(guī)范宜選用的供標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋液級(jí)及相匹配宜選用的記數(shù)測(cè)定法見(jiàn)下表3。
表3 不一樣程度規(guī)范宜選用的供標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋液級(jí)及相匹配宜選用的記數(shù)測(cè)定法
| 程度規(guī)范 cfuㄍg，ml，10cm2 |
一般2～3個(gè)供標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋液級(jí)相匹配宜采用的記數(shù)測(cè)定法 |
||||
| 源液 |
1:10（－1） |
1:102（－2） |
1:103（－3） |
1:104（－4） |
|
| ＜10 |
■ |
■ |
|
|
|
| 10 |
●■ |
■ |
|
|
|
| 100 |
●▲■ |
●■ |
■ |
|
|
| 1000 |
|
●▲■ |
●■ |
■ |
■ |
| 10000 |
|
●▲ |
●▲■ |
●■ |
●■ |
| 100000 |
|
|
●▲ |
●▲ |
|
●：平皿法（供試液體積：1mlㄍ皿）；
▲：平皿法（培養(yǎng)液稀釋液法供試液體積：＜1mlㄍ皿）；
■：塑料薄膜過(guò)濾法（供試液體積能夠 較為靈便）。
10.6.2 供試品檢測(cè)整個(gè)過(guò)程務(wù)必合乎無(wú)菌技術(shù)規(guī)定。應(yīng)用殺菌用品時(shí)，不可以觸碰很有可能環(huán)境污染的一切器皿，殺菌塑料吸管不可用口吹吸。
10.6.3 供試液從制取至添加檢測(cè)用培養(yǎng)液，不可超出1h。不然，很有可能造成微生物菌種繁育或身亡而危害記數(shù)結(jié)果。
10.6.4 供試液稀釋液及注皿時(shí)應(yīng)選勻稱(chēng)的供試液，以防導(dǎo)致試驗(yàn)差值。
10.6.5 為防止細(xì)菌菌落擴(kuò)散生長(zhǎng)發(fā)育，宜采用以下方式解決：
10.6.5.1 打開(kāi)表蓋干躁 將已凝結(jié)的瓊脂平板電腦打開(kāi)表蓋，顛倒斜放在超凈工作臺(tái)上，啟動(dòng)1～1h后盒蓋，放進(jìn)恒溫箱塑造。
10.6.5.2 換陶瓦蓋 將已凝結(jié)的瓊脂平板電腦蓋換掉新近干熱滅菌的陶瓦蓋。
10.6.5.3 加TTC 于竭盡培養(yǎng)液前，在每1000ml營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂內(nèi)添加殺菌1％TTC水溶液1ml（最后濃度值為0.001％），攪拌后竭盡平皿。
11 檢測(cè)報(bào)告撰寫(xiě)
本產(chǎn)品按《中國(guó)藥典》2010年版微生物限度檢測(cè)法規(guī)范檢測(cè)，結(jié)果合乎或不符合要求。
表4 病菌、黃曲霉菌、酵母形狀特點(diǎn)較為（營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂及玫紅鈉瓊脂平板電腦）
| 菌體形狀 |
病菌 |
黃曲霉菌 |
酵母 |
|
| 菌 落 |
尺寸 |
區(qū)別非常大，在同一平板電腦上可發(fā)生針頭尺寸至超過(guò)10mm菌落 |
一般很大，亦有細(xì)微的菌體。在同一平板電腦上生長(zhǎng)發(fā)育的菌體尺寸有時(shí)候不一致 |
大部分直徑為1～2毫米，在同一平板電腦上生長(zhǎng)發(fā)育的菌體尺寸有時(shí)候不一致 |
| 外型形狀 |
多種多樣，小而凸起或大而平扁 |
多見(jiàn)環(huán)形，有的擴(kuò)散生長(zhǎng)發(fā)育為不定形 |
培養(yǎng)液表層生長(zhǎng)發(fā)育者多見(jiàn)環(huán)形，里層生長(zhǎng)發(fā)育者為環(huán)形、鐵餅、紡錘或三角形 |
|
| 顏色 |
白、灰白色或沒(méi)有顏色，亦有淡褐、淺黃及暗紅色，菌體正反兩面色調(diào)同樣 |
小菌體灰白色，大菌落形成胞子后色調(diào)多種多樣。菌體正反兩面色調(diào)不一樣 |
乳白色或淡粉色多見(jiàn)，在同一平板電腦上色彩較單一 |
|
| 清晰度 |
全透明或不全透明 |
小菌體透明色有顯著折光率性，大菌體不全透明 |
全透明較弱 |
|
| 邊沿 |
齊整或不齊整。有放射線(xiàn)狀、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、鋸齒形、卷頭發(fā)狀。低瞄準(zhǔn)鏡下一般見(jiàn)不上邊沿 |
菌絲組成，多呈放射形 |
齊整、高倍下由此可見(jiàn)球形．卵圓環(huán)狀或假真菌狀．體細(xì)胞細(xì)膩排序 |
|
| 味道 |
一般有異味 |
通常有異味 |
多帶酒香氣 |
|
| 與培養(yǎng)液融合 |
不融合 |
融合較堅(jiān)固，不容易挑動(dòng) |
不融合，易挑動(dòng) |
|
| 生長(zhǎng)發(fā)育速率 |
一般迅速 |
比較慢 |
較快 |
|
| 細(xì) 胞 |
形狀 |
球或桿狀，細(xì)微均一。高倍鏡或油鏡下可觀(guān)查形狀 |
菌絲相輔相成．完善黃曲霉菌經(jīng)常出現(xiàn)產(chǎn)孢機(jī)構(gòu)及胞子 |
大部分為圓或橢圓狀，經(jīng)常出現(xiàn)芽體相接 |
| 排序 |
單獨(dú)、分散化或有一定的排序方法 |
絮狀交錯(cuò) |
單獨(dú)分散化 |
|
二、操縱菌查驗(yàn)
l 概述
操縱菌查驗(yàn)是用以查驗(yàn)一些特殊微生物菌種（操縱菌或別的病原菌），要求按一次驗(yàn)出結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，不會(huì)再考研復(fù)試。
因?yàn)椴倏v菌查驗(yàn)為一次性匯報(bào)試驗(yàn)結(jié)果，故應(yīng)留意方式的實(shí)效性確診（方式認(rèn)證或陽(yáng)性對(duì)照）、試驗(yàn)全過(guò)程確保和結(jié)果確診，以提升 檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性。既要防止漏驗(yàn)導(dǎo)致的假陰性結(jié)果。還要防止試驗(yàn)室環(huán)境污染導(dǎo)致的陽(yáng)性結(jié)果。
操縱菌查驗(yàn)中，涉及到試驗(yàn)室監(jiān)管菌種的分離出來(lái)評(píng)定、試品呈陽(yáng)性菌種的分離出來(lái)剖析、方式認(rèn)證實(shí)驗(yàn)中的陽(yáng)性菌實(shí)際操作等，應(yīng)在專(zhuān)業(yè)的陽(yáng)性菌試驗(yàn)室開(kāi)展。除另有要求外，陽(yáng)性菌試驗(yàn)室應(yīng)符合我國(guó)Ⅱ級(jí)院內(nèi)感染規(guī)范，陽(yáng)性菌試驗(yàn)室應(yīng)配置生物安全柜。陽(yáng)性菌實(shí)際操作不可在供試品檢測(cè)用清潔試驗(yàn)室內(nèi)開(kāi)展。
2 方式認(rèn)證
在創(chuàng)建供試品的操縱菌檢測(cè)法或原檢測(cè)法的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)生改變很有可能危害檢測(cè)結(jié)果的精確性時(shí)，解決供試品的抗菌特異性及檢測(cè)法的穩(wěn)定性開(kāi)展認(rèn)證。認(rèn)證時(shí)．按各供試品微生物限度項(xiàng)下的要求（給藥途徑）挑選相對(duì)應(yīng)的菌種，并按供試液的制取和操縱菌檢測(cè)法所要求的方式開(kāi)展。
2.1 儀器設(shè)備、機(jī)器設(shè)備及用品
見(jiàn)各操縱菌查驗(yàn)項(xiàng)下。
2.2 試液、標(biāo)示液
見(jiàn)各操縱菌查驗(yàn)項(xiàng)下。
2.3 培養(yǎng)液
見(jiàn)各操縱菌查驗(yàn)項(xiàng)下。
2.4 方式認(rèn)證用規(guī)范菌種
應(yīng)依據(jù)實(shí)際種類(lèi)項(xiàng)下的總體目標(biāo)操縱菌挑選相對(duì)應(yīng)的認(rèn)證用規(guī)范菌種，常見(jiàn)總體目標(biāo)操縱菌的規(guī)范菌種以下：
大腸埃希菌Escherichia coli[CMCC(B) 44102]
橙黃色鏈球菌Staphylococcus aureus[CMCC(B) 26003]
乙型肝炎副傷寒沙門(mén)菌Salmonella paratyphi B[CMCC(B) 50094]
銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa[CMCC(B) 10104]
生孢梭菌Clostridium sporogenes[CMCC(B)64941]
白色念珠菌Candida albicans[CMCC(F) 98001]
菌液制取取大腸埃希菌、橙黃色鏈球菌、乙型肝炎副傷寒沙門(mén)菌、銅綠假單胞菌塑造物少量，打疫苗至l0ml營(yíng)養(yǎng)成分骨頭湯培養(yǎng)液內(nèi)，置30～35℃塑造18～24小時(shí)，取勻稱(chēng)塑造物1ml，用0.9％無(wú)菌檢測(cè)氯化鈉溶液稀釋液成每1ml含菌10～100cfu的菌懸液，其菌數(shù)在做對(duì)比實(shí)驗(yàn)的另外用營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂注皿或平板電腦施膠，經(jīng)塑造后記數(shù)明確。生孢梭菌打疫苗至12ml硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)液中，置30～35℃塑造18～24小時(shí)，用0.9％無(wú)菌檢測(cè)氯化鈉溶液做成1ml含10～100cfu的菌液。
2.5 供試液的制?。ㄒ?jiàn)病菌、黃曲霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)）
2.6 認(rèn)證方式
2.6.1 實(shí)驗(yàn)組取規(guī)定量供試液和10～100cfu實(shí)驗(yàn)菌添加增菌培養(yǎng)液中，按相對(duì)應(yīng)操縱菌的檢測(cè)法開(kāi)展查驗(yàn)。當(dāng)選用塑料薄膜過(guò)濾法時(shí)，實(shí)驗(yàn)菌需加在最后一次清洗液中，清洗后，取下濾紙引至增菌培養(yǎng)液中。
2.6.2 陽(yáng)性對(duì)照 取10～100cfu實(shí)驗(yàn)菌添加增菌培養(yǎng)液中，按相對(duì)應(yīng)操縱菌的檢測(cè)法開(kāi)展查驗(yàn)。
2.6.3 陰性對(duì)照取相對(duì)應(yīng)的封閉液取代供試液，按相對(duì)應(yīng)操縱菌的檢測(cè)法開(kāi)展查驗(yàn)。
2.7 結(jié)果判斷
呈陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)應(yīng)驗(yàn)出實(shí)驗(yàn)菌，陰性對(duì)照組應(yīng)無(wú)菌檢測(cè)生長(zhǎng)發(fā)育。若實(shí)驗(yàn)組驗(yàn)出實(shí)驗(yàn)菌，按此供試液制取法和操縱菌檢測(cè)法開(kāi)展供試品的該操縱菌查驗(yàn)；若實(shí)驗(yàn)組未驗(yàn)出實(shí)驗(yàn)菌，應(yīng)創(chuàng)建新的方式，清除供試品的抗菌特異性，并再次認(rèn)證。
認(rèn)證實(shí)驗(yàn)可與供試品的操縱菌檢查另外開(kāi)展。
（一）大腸埃希菌
1 概述
大腸埃希菌（Escherichia coli）即大腸埃希菌，為腸桿菌科埃希菌屬的方式種。埃希菌屬除大腸埃希菌外，新近發(fā)覺(jué)有非脫羧反應(yīng)埃希菌等五個(gè)種。大腸埃希菌是人與溫血?jiǎng)游锬c胃內(nèi)的棲息菌，隨排泄物排出來(lái)身體之外。在藥物中驗(yàn)出大腸埃希菌。說(shuō)明該試品遭受人與溫血?jiǎng)游锏呐判刮锃h(huán)境污染，即很有可能環(huán)境污染腸胃病原菌。大腸埃希菌除一般大腸埃希菌外還有高致病大腸埃希菌，可造成嬰兒、成年人爆發(fā)式拉肚子。為保汪身體健康，口服藥品務(wù)必查驗(yàn)大腸埃希菌。
用4-羥基傘狀酮葡糖苷酸（4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，MUG）和靛栽培基質(zhì)（indole）實(shí)驗(yàn)查驗(yàn)大腸埃希菌是一項(xiàng)新技術(shù)應(yīng)用，其檢測(cè)流程為：增菌塑造后，轉(zhuǎn)種MUG蛋白胨培養(yǎng)液塑造，大部分狀況下不用從混和菌中分離出來(lái)單獨(dú)菌，如MUG、Indole實(shí)驗(yàn)為呈陽(yáng)性或呈陰性就可以匯報(bào)結(jié)果。
基本原理：運(yùn)用總體目標(biāo)菌限制酶功效的底物的水解反應(yīng)物質(zhì)，造成色調(diào)或熒光反應(yīng)做為標(biāo)示系統(tǒng)軟件來(lái)評(píng)定總體目標(biāo)菌。
試驗(yàn)證實(shí)96％的大腸埃希菌含β-葡糖苷酸酶（β-glucuronidase，GUD)，約10％的沙門(mén)氏菌屬一些菌苗也帶有此酶。MUG被GUD水解反應(yīng)，造成瑩光，因?yàn)闊晒夥磻?yīng)的敏感性較顏色反應(yīng)強(qiáng)千萬(wàn)倍，便于觀(guān)查，沒(méi)有主觀(guān)，因此用MUG評(píng)定大腸埃希菌已被廣泛運(yùn)用于臨床醫(yī)學(xué)、食品類(lèi)、飲用水、廢水等的檢驗(yàn)。單一的MUG辨別大腸埃希菌其漏驗(yàn)率達(dá)6％，由于98％的大腸埃希菌基靛栽培基質(zhì)實(shí)驗(yàn)為呈陽(yáng)性，故將MUG與靛栽培基質(zhì)實(shí)驗(yàn)融合，比只用MUG可提升 大腸埃希菌的診斷率。如MUG與Indole實(shí)驗(yàn)的反映不一致時(shí)，則需將供標(biāo)準(zhǔn)溶液的增菌塑造物用EMB瓊脂平板電腦分離出來(lái)塑造、革蘭氏染色、鏡檢查及生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)辨別。該法理論上可使大腸埃希菌的診斷率達(dá)98％。
如僅用IMViC生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)辨別大腸埃希菌屬中的大腸埃希菌，專(zhuān)屬性不強(qiáng)。
2 儀器設(shè)備、機(jī)器設(shè)備及用品（參考病菌、黃曲霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)）
3 標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)示液
3.1 0.9％無(wú)菌檢測(cè)氯化鈉溶液（配件二3.1）
3.2 無(wú)菌檢測(cè)聚磷酸鹽緩沖液（pH7.2）（配件二3.3)
3.3 無(wú)菌檢測(cè)對(duì)羥基苯甲酸水溶液（配件二2.2）
3.4 無(wú)菌檢測(cè)聚山梨酯80氯化鈉溶液（配件二3.2）
3.5 靛栽培基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液（配件二2.17）
3.6 甲基紅標(biāo)準(zhǔn)溶液（配件二4.2）
3.7 V-P標(biāo)準(zhǔn)溶液（配件二2.11，2.13）
3.8 革蘭氏染色液（配件二2.4，2.10，2.16）
3.9 中性化紅標(biāo)示液（配件二4.1）
3.10 亞甲藍(lán)標(biāo)示液（配件二4.3）
3.11 溴麝香草酚藍(lán)標(biāo)示液（配件二4.6）
3.12 酸堿性品紅標(biāo)示液（配件二4.7）
3.13 曙紅鈉標(biāo)示液（配件二4.9）
4 培養(yǎng)液
4.1 營(yíng)養(yǎng)成分骨頭湯（配件二5.1）
4.2 營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂（配件二5.2）
4.3 膽鹽乳清蛋白（BL）培養(yǎng)液（配件二5.6）
4.4 4－羥基傘狀酮葡糖苷酸蛋白胨培養(yǎng)液（配件二5.7）
4.5 乳清蛋白發(fā)醇培養(yǎng)液、乳清蛋白膽鹽發(fā)醇培養(yǎng)液、5％乳清蛋白培養(yǎng)液（配件二5.21，5.22）
4.6 蛋白胨水培養(yǎng)液（配件二5.18）
4.7 聚磷酸鹽葡萄糖水胨水培養(yǎng)液（配件二5.19）
4.8 枸櫞酸鹽培養(yǎng)液（配件二5.20）
4.9 曙紅亞甲藍(lán)（EMB）瓊脂（配件二5.8）
4.10 麥康凱瓊脂（配件二5.9）
5 提前準(zhǔn)備
5.1 對(duì)比用菌液（見(jiàn)方式認(rèn)證）
5.2 供試品的檢測(cè)量（見(jiàn)病菌、黃曲霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)5.3）
5.3 供標(biāo)準(zhǔn)溶液的制取（見(jiàn)病菌、黃曲霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)）
6 操作流程
6.1 檢測(cè)程序流程
陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn) 供試品開(kāi)展操縱菌查驗(yàn)時(shí)，應(yīng)做陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)的加菌量為10～100cfu，供試品和增菌培養(yǎng)液使用量及查驗(yàn)按供試品的操縱菌查驗(yàn)。陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)應(yīng)驗(yàn)出相對(duì)應(yīng)的操縱菌。
陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn) 取油漆稀釋劑十米1加入100ml（或200 m1）相對(duì)應(yīng)操縱菌查驗(yàn)用的增菌培養(yǎng)液中，塑造，應(yīng)無(wú)菌檢測(cè)生長(zhǎng)發(fā)育。
6.2 增菌塑造 取膽鹽乳清蛋白（BL）培養(yǎng)液3瓶，一瓶各100ml。2瓶各自添加規(guī)定量的供標(biāo)準(zhǔn)溶液（等同于供試品1g、lml、10cm2），在其中1瓶添加對(duì)比菌10～一百個(gè)作陽(yáng)性對(duì)照，第三瓶添加與供標(biāo)準(zhǔn)溶液相等的油漆稀釋劑作陰性對(duì)照。塑造18～24小時(shí)，必需時(shí)可延到48h。陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌檢測(cè)生長(zhǎng)發(fā)育。
取以上塑造物0.2ml，打疫苗至含5ml MUG培養(yǎng)液的試管嬰兒內(nèi)，塑造，于5、24小時(shí)在366nm紫外線(xiàn)下觀(guān)查，另外用未打疫苗的MUG培養(yǎng)液作本底對(duì)比。在紫外線(xiàn)下若管中塑造物展現(xiàn)淺藍(lán)色瑩光，為MUG呈陽(yáng)性；不展現(xiàn)瑩光，為MUG呈陰性。觀(guān)查后，沿塑造管的壁厚添加數(shù)滴靛栽培基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，液位呈玫瑰紅色，為靛栽培基質(zhì)呈陽(yáng)性；呈實(shí)驗(yàn)試劑原色，為靛栽培基質(zhì)呈陰性。本底對(duì)比的MUG和靛栽培基質(zhì)實(shí)驗(yàn)應(yīng)是呈陰性。如MUG呈陽(yáng)性、靛栽培基質(zhì)呈陽(yáng)性，判供試IQC出大腸埃希菌；如MUG呈陰性、靛栽培基質(zhì)呈陰性，判供樣品未驗(yàn)出大腸埃希菌。
6.3 分離出來(lái)塑造如展現(xiàn)MUG呈陽(yáng)性、靛栽培基質(zhì)呈陰性或MUG呈陰性、靛栽培基質(zhì)呈陽(yáng)性時(shí)，應(yīng)將以上供試品BL增菌細(xì)胞培養(yǎng)液輕輕地?fù)u晃，以接種環(huán)沾取1～2環(huán)細(xì)胞培養(yǎng)液畫(huà)線(xiàn)于EMB或麥康凱瓊脂平板電腦上。塑造18～24小時(shí)。若平板電腦上無(wú)菌檢測(cè)落生長(zhǎng)發(fā)育、或生長(zhǎng)發(fā)育的菌體與表1列出的菌體形狀特點(diǎn)不符合，判供樣品未驗(yàn)出大腸埃希菌。
表1 大腸埃希菌菌體形狀特點(diǎn)
| 培養(yǎng)液 |
菌體形狀 |
| 曙紅亞甲藍(lán)瓊脂 |
呈紫黑、淡紫色、紫藍(lán)色或淡粉色，菌體管理中心呈淺紫色或無(wú)顯著深色管理中心，環(huán)形，稍突起，邊沿齊整，表層光潔，潮濕，經(jīng)常出現(xiàn)金屬質(zhì)感 |
| 麥康凱瓊脂 |
鮮玫紅色或微鮮紅色，菌體管理中心呈深玫紅色，環(huán)形，平扁，邊沿齊整，表層光潔，潮濕 |
當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照的平板電腦呈典型性菌體生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)，若EMB或麥康凱瓊脂平板電腦上生長(zhǎng)發(fā)育的菌體與表1列出菌體形狀特點(diǎn)相符合或疑是者，應(yīng)挑取異常菌體開(kāi)展分離出來(lái)、提純、上色鏡檢查和IMViC實(shí)驗(yàn)，確定是不是為大腸埃希菌。
為了更好地標(biāo)準(zhǔn)實(shí)際操作，下列是對(duì)中國(guó)藥典規(guī)定的填補(bǔ)。
6.4 純塑造 如EMB或麥康凱瓊脂平板電腦上生長(zhǎng)發(fā)育的菌體與表1列出特點(diǎn)相符合或疑是者，以接種針輕輕地觸碰單獨(dú)疑是菌體的表層管理中心，沾取塑造物，應(yīng)選擇2～3個(gè)之上疑是菌體，各自打疫苗營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂斜坡，塑造18～24小時(shí)，作下列查驗(yàn)。
如平板電腦上無(wú)單獨(dú)異常菌體，但有異常菌團(tuán)（紫黑，或有金屬質(zhì)感），應(yīng)沾取異常菌團(tuán)塑造物少量，或再次取增菌細(xì)胞培養(yǎng)液畫(huà)線(xiàn)打疫苗于EMB瓊脂平板電腦，塑造18～24小時(shí)，再選擇單獨(dú)疑是菌體，純塑造，作下列查驗(yàn)。
6.5 革蘭氏染色、鏡檢查
6.5.1 以接種環(huán)沾取無(wú)菌水于清潔蓋玻片上，取以上疑是菌體的營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂斜坡新鮮塑造物少量，做成勻稱(chēng)玻片，當(dāng)然或微溫，再根據(jù)火苗2～3次干躁使固定不動(dòng)。
6.5.2 滴入結(jié)晶紫染色液，上色1min，水清洗。
6.5.3 滴入碘液，媒染1min，水清洗，以過(guò)濾紙吸走余水。
6.5.4 滴入95%酒精，褪色20～30s，至排出液沒(méi)有顏色，水清洗。
6.5.5 滴加沙黃染色液，復(fù)染1min，待干后，鏡檢查。
6.5.6 上色結(jié)果
革蘭陽(yáng)性菌呈紫藍(lán)色；革蘭陰性菌呈鮮紅色。
大腸埃希菌為革蘭呈陰性短鏈球菌，或球桿菌狀，亦有鏈球菌狀。
6.5.7 常見(jiàn)問(wèn)題
6.5.7.1 裝片務(wù)必清潔，無(wú)刮痕。玻片的菌量宜少，菌液不能太濃。不然，菌體細(xì)胞大堆或連一片。上色反映難以分辨，不好菌體細(xì)胞的形狀觀(guān)查。
如菌液太濃，須再取清潔蓋玻片進(jìn)一步稀釋液。
6.5.7.2 塑造物的菌齡以16～24小時(shí)為宜。塑造時(shí)間太長(zhǎng)的革蘭陽(yáng)性菌易染上鮮紅色。
6.5.7.3 褪色是重要。褪色時(shí)間不夠，菌體細(xì)胞易染上呈陽(yáng)性；褪色時(shí)間太長(zhǎng)，菌體細(xì)胞易染上呈陰性。
7 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)
7.1 乳清蛋白發(fā)醇實(shí)驗(yàn) 取以上斜坡塑造物，打疫苗于乳清蛋白發(fā)醇管，塑造24～48h，觀(guān)查產(chǎn)酸（顯色劑為酸堿性品紅者為鮮紅色；顯色劑為溴麝香草酚藍(lán)者為淡黃色），脹氣（小倒管中有汽泡，汽泡不管尺寸全是脹氣）。
為防止緩慢發(fā)醇乳清蛋白造成假陰性，也可以打疫苗5％乳清蛋白發(fā)醇管。絕大部分緩慢發(fā)醇乳清蛋白的病菌，可于24小時(shí)發(fā)生呈陽(yáng)性?；蜻m度增加塑造時(shí)間。
7.2 靛栽培基質(zhì)實(shí)驗(yàn)（Ⅰ） 取以上斜坡塑造物，打疫苗于蛋白胨水培養(yǎng)液，塑造24～48h，沿壁厚添加靛栽培基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液數(shù)滴，輕輕地?fù)u晃試管嬰兒，液位呈玫瑰紅色為呈陽(yáng)性，呈實(shí)驗(yàn)試劑原色為呈陰性。98％的大腸埃希菌靛栽培基質(zhì)實(shí)驗(yàn)為呈陽(yáng)性。一般24小時(shí)就可以發(fā)生呈陽(yáng)性結(jié)果，以無(wú)菌操作原則先從管內(nèi)取下1或2ml細(xì)胞培養(yǎng)液開(kāi)展查驗(yàn)，如靛栽培基質(zhì)是呈陰性，剩下的蛋白胨水塑造物再塑造24小時(shí)，作靛栽培基質(zhì)實(shí)驗(yàn)。
7.3 甲基紅實(shí)驗(yàn)（M） 取以上斜坡塑造物，打疫苗于聚磷酸鹽葡萄糖水胨水培養(yǎng)液中，塑造48±1h，于細(xì)胞培養(yǎng)液中添加甲基紅標(biāo)示液2～3滴（約每ml細(xì)胞培養(yǎng)液加標(biāo)示液1滴），輕度搖晃，馬上觀(guān)查，呈紅色或桔紅色為呈陽(yáng)性，呈淡黃色為呈陰性。
7.4 乙酰羥基乙醇轉(zhuǎn)化成實(shí)驗(yàn)（V-P） 取以上斜坡塑造物。打疫苗于聚磷酸鹽葡萄糖水胨水培養(yǎng)液中，塑造48±1h，于2ml細(xì)胞培養(yǎng)液中添加α-萘酚酒精標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml，攪拌，再加40％三氯化鐵溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2ml，充足振搖，在4h（一般 在30min）內(nèi)發(fā)生鮮紅色應(yīng)判為呈陽(yáng)性，無(wú)鮮紅色反映為呈陰性。
7.5 枸櫞酸鹽運(yùn)用實(shí)驗(yàn)（C） 取以上斜坡塑造物，打疫苗于枸櫞酸鹽培養(yǎng)液斜坡上，塑造2～四天，培養(yǎng)液斜坡有菌苔生長(zhǎng)發(fā)育，培養(yǎng)液由翠綠色變成深藍(lán)色時(shí)為呈陽(yáng)性，培養(yǎng)液色調(diào)無(wú)更改、無(wú)菌檢測(cè)生長(zhǎng)發(fā)育為呈陰性。
8 結(jié)果分辨
8.1 當(dāng)陰性對(duì)照試驗(yàn)呈陰性，陽(yáng)性對(duì)比實(shí)驗(yàn)MUG呈陽(yáng)性，供試品MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陽(yáng)性，匯報(bào)1g或1ml供試IQC出大腸埃希菌。MUG陰性、靛基質(zhì)陰性，匯報(bào)1g或1ml供試品未驗(yàn)出大腸埃希菌。
8.2 MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陰性、IMViC實(shí)驗(yàn)為－＋??、革蘭陰性鏈球菌，匯報(bào)1g或1ml供試IQC出大腸埃希菌；MUG陰性、靛基質(zhì)陽(yáng)性、IMViC實(shí)驗(yàn)為＋＋??、革蘭陰性鏈球菌，匯報(bào)1g或1ml供試IQC出大腸埃希菌。
8.3 供試品塑造物查驗(yàn)不符8.2二項(xiàng)中的任一項(xiàng)，匯報(bào)1g或1ml供試品未驗(yàn)出大腸埃希菌。
8.4 當(dāng)陰性對(duì)比有菌生長(zhǎng)發(fā)育或陽(yáng)性對(duì)比未生長(zhǎng)發(fā)育或生長(zhǎng)發(fā)育菌體并不是大腸埃希菌，不可以作出檢測(cè)報(bào)告。
9 常見(jiàn)問(wèn)題
9.1 MUG法無(wú)須從混和菌中分離出來(lái)單獨(dú)菌體。除大腸埃希菌外，還有一部分志賀菌屬、沙門(mén)氏菌屬的菌種；及其極少數(shù)革蘭陽(yáng)性革蘭陰性桿菌、鏈球菌和芽胞菌，其MUG為陽(yáng)性。因而，在MUG培養(yǎng)液成份中提升了去氧膽酸鈉的量，可清除革蘭陽(yáng)性菌的影響。在膽鹽乳清蛋白培養(yǎng)液中志賀菌、沙門(mén)氏菌較難生長(zhǎng)發(fā)育。
9.2 配置MUG培養(yǎng)液時(shí)，盡量校準(zhǔn)pH值，殺菌后pH不可過(guò)7.4，不然pH值較高，MUG溶解，自身則顯瑩光；散裝MUG培養(yǎng)液的試管嬰兒應(yīng)選擇，試管嬰兒、蛋白胨不可顯瑩光。
9.3 塑造時(shí)間 供試品細(xì)胞培養(yǎng)液打疫苗于MUG培養(yǎng)液中，一般塑造5h和24小時(shí)要觀(guān)查是不是造成瑩光，如瑩光很很弱，不可以精確分辨時(shí)，能延長(zhǎng)塑造至48h再觀(guān)查結(jié)果。因?yàn)榇竽c埃希菌各菌種間的GUD的特異性不完全一致，對(duì)底物和底物的濃度值反映的差別；培養(yǎng)液中挑選因素的危害；塑造時(shí)問(wèn)、溫度；pH值的更改；很多市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)菌和試品自身化學(xué)物質(zhì)成份的影響等，對(duì)結(jié)果的分辨亦有影響。
9.4 結(jié)果觀(guān)查 取供試品的MUG實(shí)驗(yàn)管、陽(yáng)性對(duì)照料、陰性對(duì)照料另外在366nm紫外線(xiàn)燈下觀(guān)查，陽(yáng)性對(duì)照料應(yīng)該有極強(qiáng)的淺藍(lán)色瑩光，陰性對(duì)照料無(wú)瑩光。供試品MUG管是不是有瑩光，應(yīng)認(rèn)真觀(guān)察較為，或?qū)⒏鞴芴鎿Q部位（陰性管垂直居中），適度歪斜試管嬰兒。如陽(yáng)性對(duì)照料瑩光明顯，危害供試品質(zhì)工程師與陰性對(duì)照料的觀(guān)查時(shí)，也可以移去陽(yáng)性對(duì)照料。
9.5 藥物中環(huán)境污染的大腸埃希菌，易受生產(chǎn)工藝流程及藥品的危害。在曙紅亞甲藍(lán)瓊脂或麥康凱瓊脂平板電腦上的菌體形狀特點(diǎn)時(shí)有轉(zhuǎn)變 ，挑取異常菌體通常憑工作經(jīng)驗(yàn)，主觀(guān)很大，盡量選擇2～3個(gè)之上菌體各自做IMViC實(shí)驗(yàn)辨別，選擇菌體越多，驗(yàn)出陽(yáng)性菌的概率越高，如僅選擇一個(gè)菌體做IMViC實(shí)驗(yàn)辨別．則易漏驗(yàn)。
9.6 在IMViC實(shí)驗(yàn)中，以殺菌接種針沾取菌苔，最先打疫苗于枸櫞酸鹽瓊脂斜坡上，隨后打疫苗于蛋白胨水培養(yǎng)液、聚磷酸鹽葡萄糖水胨水培養(yǎng)液中。切忌將培養(yǎng)液帶到枸櫞酸鹽瓊脂斜坡上，以防造成假陽(yáng)性結(jié)果。
依據(jù)實(shí)驗(yàn)材料，發(fā)覺(jué)一些菌塑造三天后，構(gòu)櫞磷酸鹽運(yùn)用實(shí)驗(yàn)造成陽(yáng)性，故僅塑造2天是不足的，枸櫞酸鹽運(yùn)用實(shí)驗(yàn)塑造時(shí)間能延長(zhǎng)至四天。
9.7 以IMViC實(shí)驗(yàn)來(lái)分辨大腸埃希菌屬中的大腸埃希菌是含糊的。IMViC實(shí)驗(yàn)為＋＋??者，除大腸埃希菌外，也有非活躍性大腸埃希菌（E.coli jnactive）、弗格森埃希菌（E.fergusonii）、赫爾姆埃希菌（E.hermanii）。IMViC實(shí)驗(yàn)為－＋??者，除大腸埃希菌外，也有非活躍性大腸埃希菌（E.coli inactive）、創(chuàng)口埃希菌（E.vulneris）、臭蟲(chóng)埃希菌（E.blattae）。
9.8 陽(yáng)性對(duì)比實(shí)驗(yàn)是查驗(yàn)供試品是不是有殺菌作用及塑造標(biāo)準(zhǔn)是不是適合。陽(yáng)性對(duì)比菌液的制取、記數(shù)及添加含供試品的培養(yǎng)液中等水平實(shí)際操作，不可以在檢驗(yàn)供試品的清潔試驗(yàn)室或凈化處理臺(tái)子上開(kāi)展，務(wù)必在獨(dú)立的防護(hù)間或凈化臺(tái)實(shí)際操作，以防環(huán)境污染供試品及實(shí)際操作自然環(huán)境。
9.9 在各種供試品中檢驗(yàn)大腸埃希菌以及他操縱菌，按一次驗(yàn)出結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，不會(huì)再取樣復(fù)檢。驗(yàn)出的大腸埃希菌以及他操縱菌塑造物須保存一個(gè)月，備查簿。
（二）大腸桿菌
1 概述
大腸桿菌（Coliform）就是指37℃生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)要發(fā)醇乳清蛋白，在24小時(shí)內(nèi)產(chǎn)酸脹氣的革蘭陰性無(wú)枯草芽孢菌。合乎以上界定的病菌除大腸埃希菌屬（Escherichia）的大部分菌外，還包含腸桿菌科的腸桿菌屬（Enterobacter）、枸櫞酸菌屬（Citrobacter）、克雷伯菌屬（Klebsiella）的大部分菌。大腸桿菌包含了平常人畜腸胃外需氧的的大部分革蘭陰性鏈球菌。以大腸桿菌做為環(huán)境衛(wèi)生指示菌比操縱大腸埃希菌具備普遍的微生物學(xué)實(shí)際意義，查驗(yàn)方式簡(jiǎn)單。因而，國(guó)際性?xún)?nèi)以大腸桿菌做為藥物、食品類(lèi)、飲用水等的環(huán)境衛(wèi)生指示菌，對(duì)環(huán)境衛(wèi)生品質(zhì)的規(guī)定更嚴(yán)苛。
大腸桿菌的查驗(yàn)根據(jù)增菌、分離出來(lái)、革蘭氏染色、鏡檢查和確診實(shí)驗(yàn)等流程。
2 儀器設(shè)備、機(jī)器設(shè)備及用品（見(jiàn)大腸埃希菌檢測(cè)法）
3 標(biāo)準(zhǔn)溶液、標(biāo)示液（見(jiàn)腸子埃希茵檢測(cè)法）
4 培養(yǎng)液
4.1 乳清蛋白發(fā)醇培養(yǎng)液（配件二5.21）
4.2 乳清蛋白膽鹽發(fā)醇培養(yǎng)液（配件二5.22）
4.3 曙紅亞甲藍(lán)（EMB）瓊脂（附則5.8）
4.4 麥康凱瓊脂（附則5.9）
5 對(duì)比用菌液（大腸埃希菌，同操縱菌方式認(rèn)證2.4）
6 操作流程
6.1 操作流程
6.2 增菌塑造 取乳清蛋白膽鹽發(fā)醇管3支，各自添加1:10稀釋液的供試液1ml（含供試品0.1g或0.1米1)、1:100稀釋液的供試液1ml（含供試品0.01g或0.01ml）和1:1000稀釋液的供試液1ml（含供試品0.01g或0.01ml）。另取1支乳清蛋白膽鹽發(fā)醇管，添加油漆稀釋劑1ml做為陰性對(duì)比。均塑造18～24小時(shí)，觀(guān)查結(jié)果。
加供試液的乳清蛋白膽鹽發(fā)醇管若無(wú)菌檢測(cè)生長(zhǎng)發(fā)育、或有菌生長(zhǎng)發(fā)育但不產(chǎn)酸脹氣，則判該管未驗(yàn)出大腸桿菌。若乳清蛋白膽鹽發(fā)醇管產(chǎn)酸產(chǎn)氣，應(yīng)進(jìn)一步分離出來(lái)塑造。
6.3 分離出來(lái)塑造 將以上產(chǎn)酸脹氣的發(fā)醇管內(nèi)的塑造物，各自畫(huà)線(xiàn)打疫苗于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)液或麥康凱瓊脂培養(yǎng)液的平板電腦上，塑造18～24小時(shí)。
大腸桿菌的菌體在曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)液平板電腦上呈紫黑或暗紫色，環(huán)形，稍突起，邊沿齊整，表層光潔，潮濕；在麥康凱瓊脂培養(yǎng)液的平板電腦上呈鮮玫紅色或淡粉色，環(huán)形，平扁，邊沿齊整，表層光潔，潮濕。若平板電腦上無(wú)菌檢測(cè)落生長(zhǎng)發(fā)育，或生長(zhǎng)發(fā)育的菌體與以上菌體特點(diǎn)不符合或者是為非革蘭陰性無(wú)枯草芽孢菌，判該管未驗(yàn)出大腸桿菌；若平板電腦上生長(zhǎng)發(fā)育有疑是菌體，并且是革蘭陰性無(wú)枯草芽孢菌，應(yīng)開(kāi)展確診實(shí)驗(yàn)。
6.4 確診實(shí)驗(yàn) 從以上分離出來(lái)平板電腦上選擇4～五個(gè)疑是菌體，各自打疫苗于乳清蛋白發(fā)醇管內(nèi)，塑造24～兩天。若產(chǎn)酸脹氣，判該乳清蛋白膽鹽發(fā)醇管驗(yàn)出大腸桿菌，不然判未驗(yàn)出大腸桿菌。
6.5 結(jié)果分辨 依據(jù)大腸桿菌的驗(yàn)出管數(shù)，按表2匯報(bào)1g或1ml供試品中的大腸桿菌數(shù)。
表2 大腸桿菌MPN（Most probable number）表
| 各供試品量的驗(yàn)出結(jié)果 |
最很有可能的大腸桿菌數(shù)N （個(gè)ㄍg或ml） |
||
| 1.0g或1.0Ml |
0.1g或0.1ml |
0.01g或0.01ml |
|
| ＋ |
＋ |
＋ |
＞102 |
| ＋ |
＋ |
－ |
10＜N＜102 |
| ＋ |
－ |
－ |
1＜N＜10 |
| － |
－ |
－ |
＜1 |
注：＋ 驗(yàn)出大腸桿菌。－ 未驗(yàn)出沙門(mén)氏菌
7 常見(jiàn)問(wèn)題
7.1 加供試液的乳清蛋白膽鹽發(fā)醇管，因?yàn)橛械臍堅(jiān){(diào)較深或沉淀較多，影響結(jié)果的觀(guān)查。應(yīng)認(rèn)真觀(guān)察倒管底端或試管嬰兒壁、細(xì)胞培養(yǎng)液表層有沒(méi)有氣泡。針頭大的汽泡也是脹氣。
7.2 乳清蛋白膽鹽發(fā)醇培養(yǎng)液內(nèi)的倒管不小于30mm×3毫米（內(nèi)徑）。不然，倒管被殘?jiān)鼡踝。闊┯^(guān)查結(jié)果。
7.3 加供試液的乳清蛋白膽鹽發(fā)醇管，經(jīng)塑造后，其倒管中不管脹氣是多少，均應(yīng)做分離出來(lái)塑造，革蘭氏染色、鏡檢查。如脹氣太少，能延長(zhǎng)塑造時(shí)間。
7.5 盡量多選擇曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)液或麥康凱瓊脂培養(yǎng)液平板電腦上大腸桿菌的異常菌體，做乳清蛋白發(fā)醇確診實(shí)驗(yàn)。挑異常菌體越多，可提升 大腸桿菌診斷率。
（三）沙門(mén)氏菌
1 概述
沙門(mén)氏菌屬是腸桿菌科的關(guān)鍵病原菌，按《Bergey系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》第一卷（1984），沙門(mén)氏菌分五個(gè)亞屬，2003年出版發(fā)行的第八版的《臨床微生物手冊(cè)》將沙門(mén)氏菌屬分為2個(gè)菌苗及結(jié)腸炎沙門(mén)氏菌和乍得沙門(mén)氏菌，在其中的結(jié)腸炎沙門(mén)氏菌分6個(gè)亞屬，包含普遍的傷寒論、甲形副傷寒、乙型肝炎副傷寒、丙型副傷寒、鼠傷寒論，豬霍亂等沙門(mén)氏菌以?xún)?nèi)，那時(shí)候已發(fā)覺(jué)2501個(gè)血清型。O抗原體抗血清的A-E群包括了沙門(mén)氏菌分離出來(lái)株的95％，因此用沙門(mén)氏菌A-FO鞭毛抗原血清蛋白開(kāi)展沙門(mén)氏菌初篩實(shí)驗(yàn)。藥物中的沙門(mén)氏菌，是以評(píng)定沙門(mén)氏菌屬為標(biāo)準(zhǔn)，即對(duì)每20g（或十米1）藥物中是不是驗(yàn)出沙門(mén)氏菌做出檢測(cè)報(bào)告。
因?yàn)樯抽T(mén)氏菌血清型多種多樣，各血清型的生物化學(xué)及血清學(xué)特點(diǎn)雖息息相關(guān)，卻各有不同，選用一種增菌培養(yǎng)液和二種分離出來(lái)培養(yǎng)液，不太可能包含全部沙門(mén)氏菌的適宜增菌及分離出來(lái)標(biāo)準(zhǔn)。除此之外，因?yàn)樗幬镌谏a(chǎn)過(guò)程中，常遭受加溫、干躁等生產(chǎn)加工流程的危害，藥物中環(huán)境污染的沙門(mén)氏菌可遭受損害或呈休眠模式，故須在增菌塑造前先開(kāi)展預(yù)增菌，隨后再開(kāi)展增菌及分離出來(lái)、三糖鐵瓊脂基本辨別、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)、血清學(xué)實(shí)驗(yàn)等流程。
2 儀器設(shè)備、機(jī)器設(shè)備及用品（見(jiàn)大腸埃希菌檢測(cè)法2）
3 標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)示液（參照大腸埃希菌檢測(cè)法3）
3.1 無(wú)菌檢測(cè)脲標(biāo)準(zhǔn)溶液（配件二2.5）
3.2 酚磺酞標(biāo)示液（配件二4.4）
3.3 亮綠標(biāo)準(zhǔn)溶液（配件二2.9）
3.4 氰化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液（配件二2.14）
3.5 溴甲酚紫標(biāo)示液（配件二4.5）
3.6 革蘭氏染色液（配件二2.4，2.10，2.16）
3.7 沙門(mén)氏菌屬A～F“0”鞭毛抗原血清蛋白（0鞭毛抗原1）。
4 培養(yǎng)液
4.1 營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂培養(yǎng)液（配件二5.2）
4.2 營(yíng)養(yǎng)成分骨頭湯培養(yǎng)液（配件二5.1）
4.3 半固態(tài)營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂培養(yǎng)液（配件二5.3）
4.4 曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)液（EMB）（配件二5.8）
4.5 麥康凱瓊脂培養(yǎng)液（MacC）（配件二5.9）
4.6 四硫磺粉酸鈉緩釋片亮綠培養(yǎng)液（TTB）（配件二5.11）
4.7 三糖鐵瓊脂培養(yǎng)液（TSI）（配件二5.10）
4.8 膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)液（DHL）（配件二5.13）
4.9 沙門(mén)氏菌扁志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)液（S.S）（配件二5.12）
4.10 蛋白胨水培養(yǎng)液（配件二5.18）
4.11 脲（尿素溶液）瓊脂培養(yǎng)液（配件二5.23）
4.12 氰化鉀培養(yǎng)液（配件二5.24）
4.13 磷酸氫鈣脫羧酶培養(yǎng)液（配件二5.25）
5 對(duì)比用菌液
取乙型肝炎副傷寒沙門(mén)菌[CMCC(B) 50094]的塑造物少量，打疫苗至10ml營(yíng)養(yǎng)成分骨頭湯培養(yǎng)液內(nèi)。30～35℃塑造18～24小時(shí)后，用0.9％無(wú)菌檢測(cè)氯化鈉溶液按10倍增長(zhǎng)稀釋液濃度值等同于10～100cfuㄍml，作陽(yáng)性對(duì)照用菌液。其菌液濃度值可以用平板電腦菌落計(jì)數(shù)法測(cè)出。
6 操作步驟
6.1 準(zhǔn)備工作：[見(jiàn)病菌、黃曲霉菌（酵母）記數(shù)6 ]
6.2 增菌塑造
6.2.1 預(yù)增菌取營(yíng)養(yǎng)成分骨頭湯培養(yǎng)液3份，每一份200ml，1份添加20g或是10ml供試品，攪拌；1份添加供試品及陽(yáng)性對(duì)照菌10～100cfu，攪拌；1份添加油漆稀釋劑10ml作陰性對(duì)照，30～35℃塑造18～24小時(shí)后觀(guān)查。搖晃陰性對(duì)照瓶后應(yīng)清澈全透明，無(wú)菌檢測(cè)生長(zhǎng)發(fā)育。
6.2.2 增菌塑造 輕度搖晃供試品增菌塑造瓶及陽(yáng)性對(duì)照瓶，各自汲取1ml打疫苗于1管含10ml四硫磺粉酸鈉緩釋片亮綠培養(yǎng)液的試管嬰兒中，塑造18～24小時(shí)。
6.3 分離出來(lái)塑造輕度搖晃供試品增菌塑造瓶及陽(yáng)性對(duì)照瓶，各自以接種環(huán)沾取1～2環(huán)細(xì)胞培養(yǎng)液打疫苗于膽鹽硫乳瓊脂（DHL）或沙門(mén)氏菌志賀菌瓊脂（SS）平板電腦及曙紅亞甲藍(lán)（EMB）瓊脂或麥康凱瓊脂平板電腦各一個(gè)，顛倒塑造24～48h，必需時(shí)增加至40～48h。查驗(yàn)平板電腦上面有毫無(wú)疑問(wèn)似沙門(mén)氏菌菌體。沙門(mén)氏菌在以上平板電腦上的菌體形狀特點(diǎn)見(jiàn)下表。
表3 沙門(mén)氏菌的菌體特點(diǎn)
| 平板電腦 |
菌體形狀 |
| 膽鹽硫乳瓊脂（DHL） |
沒(méi)有顏色至淺橙色．透明色，菌體管理中心帶灰黑色或所有灰黑色或無(wú)灰黑色 |
| 沙門(mén)氏菌屬志賀菌屬瓊脂（S.S） |
沒(méi)有顏色至暗紅色，透明色或不全透明，菌體管理中心有時(shí)候帶深褐色 |
| 曙紅亞甲藍(lán)瓊脂（EMB） |
沒(méi)有顏色至淺橙色，全透明或透明色，光潔潮濕的環(huán)形菌體 |
| 麥康凱瓊脂（MacC） |
沒(méi)有顏色至淺橙色，全透明或透明色，菌體管理中心有時(shí)候?yàn)樯钌? |
因?yàn)樯抽T(mén)氏菌不發(fā)醇乳清蛋白和綿白糖，不產(chǎn)酸，菌體不上色，一般為沒(méi)有顏色透明色，大部分沙門(mén)氏菌因造成H2S，菌體管理中心展現(xiàn)灰黑色乃至全黑色，在DHL瓊脂平板電腦上比較顯著。在SS瓊脂平板電腦上，H2S特點(diǎn)有時(shí)候不顯著，沙門(mén)氏菌屬亞屬I(mǎi)II因大部分菌種發(fā)醇乳清蛋白，故在以上平板電腦上的乳清蛋白發(fā)醇菌體展現(xiàn)粉色或藍(lán)紫色，但因?yàn)樵斐蒆2S，在有H2S標(biāo)示系統(tǒng)軟件的平板電腦上仍發(fā)生灰黑色管理中心。在以上培養(yǎng)液上，有一些非沙門(mén)氏菌屬病菌，也可展現(xiàn)相近沙門(mén)氏菌菌體形狀，須進(jìn)一步辨別。因?yàn)樗幤返奈：蚍堑湫途N的存有，沙門(mén)氏菌菌體可展現(xiàn)非典型形狀，如顏色變深，菌體不光滑等，應(yīng)留意鑒別。
6.4 基本辨別實(shí)驗(yàn)
從每一個(gè)供試品的分離出來(lái)平板電腦上挑取2～3個(gè)疑是菌體（菌體形狀特點(diǎn)與表3列出的形狀特點(diǎn)相符合或疑是）各自打疫苗于三糖鐵瓊脂斜坡，打疫苗時(shí)要以接種針輕輕地觸碰單獨(dú)菌體管理中心位置，沾取塑造物畫(huà)線(xiàn)于三糖鐵瓊脂斜坡（或是克氏雙糖鐵瓊脂斜坡）并穿刺術(shù)到最底層或先穿刺術(shù)最底層再畫(huà)線(xiàn)斜坡，塑造18～24小時(shí)，觀(guān)查結(jié)果。
疑是沙門(mén)氏菌在三糖鐵瓊脂斜坡上的反映為：①斜坡鮮紅色（產(chǎn)堿），最底層灰黑色（產(chǎn)H2S）并表明淡黃色（產(chǎn)酸）；②斜坡鮮紅色，最底層淡黃色；③斜坡淡黃色，最底層灰黑色，并表明淡黃色。大部分沙門(mén)氏菌在三糖鐵瓊脂上造成汽體，使最底層瓊脂發(fā)生汽泡或使瓊脂破裂，但也是有不造成汽體的菌苗。對(duì)在三糖鐵瓊脂斜坡淡黃色并另外最底層無(wú)灰黑色，斜坡末見(jiàn)鮮紅色最底層末見(jiàn)淡黃色，或斜坡及最底層均為鮮紅色者能夠 清除沙門(mén)氏菌。
將疑是沙門(mén)氏菌的三糖鐵瓊脂或營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂斜坡塑造物作生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)，血清蛋白凝結(jié)實(shí)驗(yàn)及革蘭氏染色，鏡檢查。沙門(mén)氏菌應(yīng)是革蘭呈陰性鏈球菌。
6.5 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)
6.5.1 靛栽培基質(zhì)實(shí)驗(yàn) 用接種環(huán)沾取少量塑造物，打疫苗到蛋白胨水培養(yǎng)液中，照大腸埃希菌檢測(cè)法靛栽培基質(zhì)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)下實(shí)際操作、分辨結(jié)果。沙門(mén)氏菌應(yīng)是陰性反應(yīng)。
6.5.2 脲酶實(shí)驗(yàn) 用接種環(huán)沾取少量塑造物，畫(huà)線(xiàn)打疫苗于脲瓊脂斜坡，塑造24小時(shí)，觀(guān)查結(jié)果。斜坡變成鮮紅色為陽(yáng)性反應(yīng)，沙門(mén)氏菌屬為陰性反應(yīng)。
6.5.3 氰化鉀實(shí)驗(yàn) 將塑造物先打疫苗至營(yíng)養(yǎng)成分骨頭湯培養(yǎng)液中塑造20～24小時(shí)，用接種環(huán)沾取細(xì)胞培養(yǎng)液1環(huán)，打疫苗至氰化鉀培養(yǎng)液內(nèi)，另取一環(huán)細(xì)胞培養(yǎng)液打疫苗于沒(méi)有氰化鉀的一樣培養(yǎng)液內(nèi)對(duì)著干照料，打疫苗后就是以橡膠塞塞緊，塑造24～48h，觀(guān)查結(jié)果。對(duì)比管中有菌生長(zhǎng)發(fā)育（渾濁），而實(shí)驗(yàn)管也是有菌生長(zhǎng)發(fā)育為陽(yáng)性反應(yīng)；對(duì)照料有菌生長(zhǎng)發(fā)育（渾濁）而實(shí)驗(yàn)管無(wú)菌檢測(cè)生長(zhǎng)發(fā)育（清澈）為陰性反應(yīng)。沙門(mén)氏菌應(yīng)是陰性反應(yīng)。
本實(shí)驗(yàn)應(yīng)十分注意密封性支管，夏季散裝培養(yǎng)液宜在冰浴中開(kāi)展，避免 氰化鉀溶解，造成氫氰酸逸出，導(dǎo)致培養(yǎng)液內(nèi)氰化鉀濃度值減少，不能抑制病菌生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致陽(yáng)性。
氰化鉀為劇毒品、實(shí)際操作時(shí)需慎重，切忌用口吸液管。用后的培養(yǎng)液每管加數(shù)粒硫酸鋁和20％三氯化鐵溶液0.5ml去毒。隨后再殺菌、清洗。
6.5.4 磷酸氫鈣脫羧酶實(shí)驗(yàn)用接種環(huán)沾取少量塑造物，打疫苗在磷酸氫鈣脫羧酶培養(yǎng)液中，另外打疫苗一支沒(méi)有磷酸氫鈣的一樣培養(yǎng)液做為對(duì)照料，塑造24～48h觀(guān)查結(jié)果。對(duì)照料淡黃色（產(chǎn)酸），實(shí)驗(yàn)管呈藍(lán)紫色為陽(yáng)性反應(yīng)（磷酸氫鈣脫羧反應(yīng)產(chǎn)堿）；實(shí)驗(yàn)管淡黃色為陰性反應(yīng)。沙門(mén)氏菌應(yīng)是陽(yáng)性反應(yīng)。
6.5.5 驅(qū)動(dòng)力實(shí)驗(yàn)用接種針沾取塑造物，穿刺接種于半固態(tài)營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂管內(nèi)，塑造24小時(shí)，觀(guān)查結(jié)果。有驅(qū)動(dòng)力的病菌能在穿刺術(shù)線(xiàn)之外的培養(yǎng)液內(nèi)外擴(kuò)散生長(zhǎng)發(fā)育使培養(yǎng)液呈渾濁狀況；無(wú)驅(qū)動(dòng)力的病菌僅能沿穿刺術(shù)線(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育，不向擴(kuò)散，培養(yǎng)液仍呈清楚全透明狀；無(wú)驅(qū)動(dòng)力主要表現(xiàn)的塑造物，應(yīng)在室內(nèi)溫度保存2～三天后，再次觀(guān)查。沙門(mén)氏菌除雛雞沙門(mén)氏菌及無(wú)驅(qū)動(dòng)力的變異外，均具備全身微絨毛，能健身運(yùn)動(dòng)，驅(qū)動(dòng)力實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性。沙門(mén)氏菌生化反應(yīng)的基本辨別見(jiàn)下表。
表4 沙門(mén)氏菌與相關(guān)病菌在三糖鐵瓊脂及基本生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的辨別
| 編號(hào) |
|
靛栽培基質(zhì) |
脲酶 |
氰化鉀 |
磷酸氫鈣脫羧酶 |
判斷菌屬 |
|||
| 斜坡 |
最底層 |
脹氣 |
氯化氫 |
||||||
| 1.1 |
－ |
＋ |
＋／－ |
＋／－ |
－ |
－ |
－ |
＋ |
沙門(mén)氏菌屬 |
| 1.2 |
＋／－ |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
－ |
＋ |
沙門(mén)氏菌屬I(mǎi)II |
| 2 |
－ |
＋ |
＋／－ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
＋ |
遲緩愛(ài)得華菌屬 |
| 3 |
＋／－ |
－ |
＋／－ |
＋／－ |
－／＋ |
－／＋ |
＋／－ |
－ |
弗勞地檸檬酸鈉鏈球菌 |
| 4.1 |
－ |
＋ |
＋S |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
奇特變形桿菌 |
| 4.2 |
－ |
＋ |
＋／－S |
＋ |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
一般變形桿菌 |
| 5 |
＋／－ |
＋ |
＋／－ |
－ |
＋／－ |
－ |
－ |
＋／－ |
大腸埃希菌 |
| 6 |
－ |
＋ |
－ |
－ |
－／＋ |
－ |
－ |
－ |
志賀菌屬 |
| 7.1 |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
＋／－ |
＋ |
－ |
陰溝腸桿菌 |
| 7.2 |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
＋／－ |
＋ |
＋ |
肺部感染克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌 |
| 8 |
－ |
＋ |
＋S／－ |
－ |
＋ |
＋／－ |
＋ |
－ |
普羅菲登斯菌屬、麥考利菌屬 |
| 9 |
－ |
＋ |
＋／－ |
－ |
－ |
－／＋ |
＋ |
＋ |
蜂巢哈夫犬菌、黏質(zhì)沙雷菌 |
對(duì)于三糖鐵瓊脂上的反映，＋產(chǎn)酸（淡黃色），陽(yáng)性，陽(yáng)性率，＞90％；－產(chǎn)堿（鮮紅色），陰性，陰性率，＞90％；＋／－大部分陽(yáng)性、極少數(shù)陰性；＋S造成小量汽體；生物化學(xué)試驗(yàn)的結(jié)果參照此章6.5內(nèi)容；＋陽(yáng)性，陽(yáng)性率，＞90％；－陰性，陰性率，＞90％；＋／－大部分陽(yáng)性、極少數(shù)陰性，－／＋大部分陰性、極少數(shù)陽(yáng)性（此表根據(jù)何曉青疾病預(yù)防病菌檢測(cè)，參照第八版《美國(guó)臨床微生物手冊(cè)》，反映序號(hào)1除典型性反映外，脲酶、氰化鉀試驗(yàn)、磷酸氫鈣脫羧酶試驗(yàn)三項(xiàng)中有一項(xiàng)出現(xiàn)異常；反映編號(hào)2僅靛栽培基質(zhì)陽(yáng)性；可融合血清學(xué)凝結(jié)試驗(yàn)，或加做一部分生物化學(xué)試驗(yàn)，判斷是不是為沙門(mén)氏菌，別的狀況可清除沙門(mén)氏菌。
6.6 血清學(xué)凝結(jié)試驗(yàn)
6.6.1 提前準(zhǔn)備1片清潔的殺菌蓋玻片，在近中間的一端，以直徑3毫米接種環(huán)沾取沙門(mén)氏菌屬0鞭毛抗原1血清蛋白2～3環(huán)做成與裝片厚徑相豎直的條型擦抹，約長(zhǎng)1.5厘米，寬約0.5厘米。另一端用鹽水替代血清蛋白同法實(shí)際操作，做為陰性對(duì)比。
6.6.2 用接種環(huán)各自挑取三糖鐵瓊脂斜坡或營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂斜坡的新鮮塑造物少量，在血清蛋白和食鹽水中攪拌。菌量要適度，勿太濃。
6.6.3 將裝片前后左右歪斜多次，以深色情況襯底，在優(yōu)良的照明燈具標(biāo)準(zhǔn)下開(kāi)展觀(guān)查，陰性對(duì)比不發(fā)生凝結(jié)狀況，試驗(yàn)組一切水平的凝結(jié)狀況全是陽(yáng)性反映。陽(yáng)性反映一般 在3min內(nèi)產(chǎn)生。有時(shí)候因血清蛋白效價(jià)低、反映緩慢時(shí)，應(yīng)將裝片置細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，并放一個(gè)濕藥棉在旁邊，蓋上皿蓋，經(jīng)約20min，再觀(guān)查結(jié)果。假如依然沒(méi)有發(fā)生凝結(jié)，應(yīng)取斜坡塑造物，置含小量鹽水的試管嬰兒中，做成濃菌懸液，在100℃水浴中隔熱保溫30min，以去除很有可能存有的Vi抗原體，待冷，再做凝結(jié)試驗(yàn)，如發(fā)生凝結(jié)，仍算為陽(yáng)性反映；如不發(fā)生凝結(jié)狀況，則為陰性反映。
6.6.4 如對(duì)比試驗(yàn)發(fā)生凝結(jié)狀況為特異反映，須對(duì)該菌種塑造物開(kāi)展解決后再作凝結(jié)試驗(yàn)。
7 結(jié)果分辨
7.1 供試品塑造物為革蘭陰性鏈球菌，三糖鐵瓊脂反映及生化反應(yīng)合乎沙門(mén)氏菌屬反映，沙門(mén)氏菌屬0鞭毛抗原1血清蛋白凝結(jié)試驗(yàn)陽(yáng)性反映（含待檢塑造物經(jīng)l00℃30min解決后凝結(jié)試驗(yàn)為陽(yáng)性反映），匯報(bào)20g或10ml供試IQC出沙門(mén)氏菌。
7.2 供試品塑造物三糖鐵瓊脂反映或生化反應(yīng)不符沙門(mén)氏菌屬反映及沙門(mén)氏菌屬0鞭毛抗原1血清蛋白凝結(jié)試驗(yàn)為陰性反映（含待檢塑造物經(jīng)100℃30min解決后凝結(jié)試驗(yàn)為陰性反映），匯報(bào)1g或1ml供試品未驗(yàn)出沙門(mén)氏菌。
7.3 供試品塑造物發(fā)生以下?tīng)顩r應(yīng)再次評(píng)定或保存菌苗提交相關(guān)企業(yè)進(jìn)一步評(píng)定后，再匯報(bào)工作。
7.3.1 供試品塑造物生化反應(yīng)合乎沙門(mén)氏菌屬反映，沙門(mén)氏菌屬0鞭毛抗原1血清蛋白凝結(jié)試驗(yàn)陰性反映。
7.3.2 供試品塑造物生化反應(yīng)不符沙門(mén)氏菌屬反映，沙門(mén)氏菌屬0鞭毛抗原1血清蛋白凝集反應(yīng)呈陽(yáng)性反映。
7.4 對(duì)已驗(yàn)出沙門(mén)氏菌的供試品分離出來(lái)菌苗，有條件者，應(yīng)進(jìn)一步作菌型評(píng)定。依據(jù)驗(yàn)出菌的特點(diǎn)，推論很有可能菌型，提升生物化學(xué)試驗(yàn)新項(xiàng)目及沙門(mén)氏菌單因素血清蛋白“O”及“H”凝結(jié)試驗(yàn)開(kāi)展評(píng)定。
8 常見(jiàn)問(wèn)題
8.1 試驗(yàn)用培養(yǎng)液，需歷經(jīng)品質(zhì)評(píng)定，用已經(jīng)知道典型性反映菌種（如乙型肝炎副傷寒沙門(mén)菌[CMCC(B) 50094]開(kāi)展檢測(cè)，其敏感度及特征反映應(yīng)符合規(guī)定。培養(yǎng)液需要在要求標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存，在要求時(shí)間內(nèi)應(yīng)用。分離出來(lái)平板電腦在應(yīng)用前應(yīng)置30～35℃溫箱里顛倒孵育1～1h，使其表層溫暖潮濕，有利于分離出來(lái)沙門(mén)氏菌。
8.2 在對(duì)供試品開(kāi)展檢測(cè)的另外，需要陽(yáng)性菌對(duì)比及陰性對(duì)比。陰性對(duì)呼應(yīng)無(wú)菌檢測(cè)生長(zhǎng)發(fā)育，陽(yáng)性對(duì)呼應(yīng)表明陽(yáng)性結(jié)果，不然檢測(cè)結(jié)果失效。在開(kāi)展陽(yáng)性菌對(duì)比試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)與供試品檢測(cè)分離實(shí)際操作，防止環(huán)境污染。尤其是用接種環(huán)沾取菌液開(kāi)展打疫苗或分離出來(lái)時(shí)，防止姿勢(shì)過(guò)大，產(chǎn)生大氣氣溶膠，環(huán)境污染供試品檢測(cè)用品及實(shí)際操作自然環(huán)境。
8.3 為確保試驗(yàn)方式的穩(wěn)定性，對(duì)分離出來(lái)平板電腦上的疑是菌體，應(yīng)多選擇好多個(gè)菌體另外開(kāi)展試驗(yàn)。挑取菌體時(shí)，不要在分離出來(lái)平板電腦菌體聚集位置挑取異常菌體，而應(yīng)在菌體遍布稀少位置選擇。
8.4 生物化學(xué)試驗(yàn)及血清學(xué)試驗(yàn)的被評(píng)定塑造物務(wù)必是純塑造物，不然，不太可能獲得恰當(dāng)結(jié)果。如遇血清學(xué)凝結(jié)試驗(yàn)陽(yáng)性而生物化學(xué)試驗(yàn)不符時(shí)，應(yīng)最先查驗(yàn)塑造物的純凈度。對(duì)已環(huán)境污染的塑造物，不可丟掉，由于環(huán)境污染菌很有可能遮蓋沙門(mén)氏菌，故解決被環(huán)境污染的塑造物再次分離出來(lái)，細(xì)心選擇單獨(dú)菌體再開(kāi)展試驗(yàn)。
8.5 全部生化反應(yīng)均需依照要求的試驗(yàn)規(guī)定開(kāi)展，如觀(guān)查三糖鐵瓊脂斜坡反映的時(shí)間，應(yīng)在24士1h，時(shí)間過(guò)短太長(zhǎng)，都很有可能發(fā)生不正確結(jié)果分辨。又如氰化鉀試驗(yàn)，試管嬰兒口應(yīng)密塞，不然氰化鉀濃度值減少，導(dǎo)致殺菌作用降低，造成不正確的判斷結(jié)果。
8.6 血清蛋白凝結(jié)試驗(yàn)的影響因素甚多，除與電解質(zhì)溶液、pH、溫度相關(guān)外，須需注意抗原體與抗原使用量的占比適當(dāng)，僅有當(dāng)二者濃度值適度時(shí)，凝集反應(yīng)方顯著由此可見(jiàn)。因?yàn)榇朔椒ㄔ囼?yàn)用鞭毛抗原血清蛋白，其凝集力相對(duì)性較差，試驗(yàn)用菌液量切不可以過(guò)大。檢測(cè)前，運(yùn)用已經(jīng)知道陽(yáng)性菌檢測(cè)以把握適合菌液濃度值。
8.7 沙門(mén)氏菌為腸胃關(guān)鍵病原菌，實(shí)際操作時(shí)要需注意避免 分離出來(lái)待檢菌及陽(yáng)性對(duì)比菌對(duì)實(shí)際操作自然環(huán)境及試驗(yàn)的環(huán)境污染。全部使用過(guò)的增菌、分離出來(lái)、生物化學(xué)試驗(yàn)培養(yǎng)液、血清學(xué)凝結(jié)試驗(yàn)及上色鏡檢查后的裝片等，均需經(jīng)殺菌后才能清洗。
（四）銅綠假單胞菌
1 概述
銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），習(xí)稱(chēng)綠膿桿菌，為假單胞菌屬菌苗，普遍遍布在土壤層，水及氣體，動(dòng)物和人的肌膚、腸胃、呼吸系統(tǒng)均有存有，故可根據(jù)自然環(huán)境和生產(chǎn)制造的各個(gè)階段環(huán)境污染藥物。本菌是普遍的生膿性感柒菌、在燙傷、燒傷，骨科以及他普外疾病中常會(huì)造成繼發(fā)感染，因?yàn)楸揪鷮?duì)很多抗菌藥具備純天然的抗藥性，提升了醫(yī)治的難度系數(shù)、世界各國(guó)中國(guó)藥典均將銅綠假單胞菌查驗(yàn)列入檢查項(xiàng)目之一。銅綠假單胞菌按增菌、分離出來(lái)、純塑造、革蘭氏染色鏡檢查及生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)等流程開(kāi)展檢測(cè)。
2 儀器設(shè)備、機(jī)器設(shè)備和用品（見(jiàn)腸子埃希茵檢測(cè)法2）
3 標(biāo)準(zhǔn)溶液、標(biāo)示液
3.1 0.9%無(wú)菌檢測(cè)氯化鈉溶液或聚磷酸鹽緩沖溶液（配件二3.1，3.3）
3.2 1%二硫酸二甲基對(duì)苯二胺標(biāo)準(zhǔn)溶液（配件二2.1）
3.3 硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（配件二2.12）
3.4 三氯甲烷（配件二1.57）
4 培養(yǎng)液
4.1 營(yíng)養(yǎng)成分骨頭湯培養(yǎng)液（配件二5.1）
4.2 膽鹽乳清蛋白（BL）培養(yǎng)液（配件二5.6）
4.3 營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂培養(yǎng)液（配件二5.2）
4.4 溴代十六烷基三甲胺（配件二5.14）
4.5 綠膿菌素測(cè)量用培養(yǎng)液（PDP瓊脂）（配件二5.26）
4.6 果膠培養(yǎng)液（配件二5.27）
4.7 磷酸鹽胨水培養(yǎng)液（配件二5.28）
5 對(duì)比用菌液
銅綠假單胞菌[CMCC(B) 10104]營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂斜坡塑造物少量，打疫苗至10ml營(yíng)養(yǎng)成分骨頭湯培養(yǎng)液內(nèi)，于30～35℃塑造18～24小時(shí)后，用0.9％無(wú)菌檢測(cè)氯化鈉溶液按10倍增長(zhǎng)稀釋液濃度值等同于10～一百個(gè)cfu／ml，作陽(yáng)性對(duì)照用菌液。其菌液濃度值可在做陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)的另外用平板電腦菌落計(jì)數(shù)法測(cè)出。
6 操作步驟
6.1 供試品的抽樣量[見(jiàn)病菌、黃曲霉菌(酵母)記數(shù)6]
6.2 供標(biāo)準(zhǔn)溶液的制取[見(jiàn)病菌、黃曲霉菌(酵母)記數(shù)7]
6.3 增菌塑造
取膽鹽乳清蛋白培養(yǎng)液3份，每一份100ml，1份添加1:10供標(biāo)準(zhǔn)溶液10ml（等同于供試品1g或1ml）；1份添加供標(biāo)準(zhǔn)溶液及陽(yáng)性對(duì)照菌；l份添加與供標(biāo)準(zhǔn)溶液相等的油漆稀釋劑作陰性對(duì)照。于30～35℃塑造18～24小時(shí)（必需時(shí)可延到48h）。陰性對(duì)照菌應(yīng)無(wú)菌檢測(cè)生長(zhǎng)發(fā)育。
6.4 分離出來(lái)塑造
輕輕地?fù)u晃以上增菌細(xì)胞培養(yǎng)液，以接種環(huán)取1～2環(huán)細(xì)胞培養(yǎng)液（若有菌膜應(yīng)挑取之），畫(huà)線(xiàn)打疫苗于溴代十六烷基三甲胺瓊脂平板電腦，于30～35℃塑造18～24小時(shí)。銅綠假單胞菌在該培養(yǎng)液平板電腦上的典型性菌體為平扁、環(huán)形或不定形、邊沿參差不齊，光潔潮濕，呈灰白，附近略呈擴(kuò)散現(xiàn)象，在菌體鄰近處經(jīng)常出現(xiàn)結(jié)合狀況。菌體周邊經(jīng)常出現(xiàn)水溶深藍(lán)色素外擴(kuò)散，使培養(yǎng)液顯深藍(lán)色，但亦有不產(chǎn)黑色素的菌種。菌體也有不光滑型和粘液型等，應(yīng)留意選擇。
6.5 純塑造
供試品分離出來(lái)平板電腦生長(zhǎng)發(fā)育6.4上述典型性菌體或呈疑是菌體時(shí)，以接種針輕輕地觸碰單獨(dú)菌體的表層管理中心，沾取塑造物，應(yīng)挑取2～3個(gè)疑是菌體，各自打疫苗營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂斜坡，塑造，作下列查驗(yàn)。
6.6 革蘭氏染色鏡檢查
6.6.1 革蘭氏染色（見(jiàn)大腸埃希菌查驗(yàn)6.5）
6.6.2 鏡檢查
銅綠假單胞菌為革蘭呈陰性、無(wú)枯草芽孢菌，單獨(dú)，成雙或成挎包排序。
6.7 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)
可以用銅綠假單胞菌[CMCC(B) 10104]做生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照株。
6.7.1 抗霉素實(shí)驗(yàn)
取一小塊乳白色清潔的過(guò)濾紙置平皿內(nèi)，以無(wú)菌檢測(cè)玻璃棒挑取營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂斜坡塑造物少量，涂在過(guò)濾紙上，隨后滴入1滴新配置的1％二硫酸二甲基對(duì)苯二胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，在30s內(nèi)，紙條上的塑造物發(fā)生淡粉色，慢慢變成暗紫色，即是抗霉素實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)。若塑造物不掉色或僅顯粉紅色為陰性反應(yīng)。
本實(shí)驗(yàn)應(yīng)留意：
（1）實(shí)驗(yàn)菌體（苔）務(wù)必新鮮，老舊塑造物反映結(jié)果不靠譜。
（2）實(shí)驗(yàn)防止與鐵、鎳等金屬材料觸碰，不能用一般接種針（環(huán)）（鉑金原材料以外）挑取菌（苔），不然易發(fā)生陽(yáng)性。宜用玻璃棒或木棍。
（3）實(shí)驗(yàn)試劑宜新鮮配置，置放太久，二硫酸二甲基對(duì)苯二胺空氣氧化掉色不能用。
（4）反映需要在有氧運(yùn)動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)下開(kāi)展，勿滴入實(shí)驗(yàn)試劑太多，以防泡浸塑造物使之與氣體阻隔，導(dǎo)致假陰性反應(yīng)。
（5）麥康凱、SS培養(yǎng)液等含糖量培養(yǎng)液上的菌體不適合做抗霉素實(shí)驗(yàn)，由于糖溶解產(chǎn)酸抑止抗霉素特異性。
6.7.2 綠膿菌素實(shí)驗(yàn)
取營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂斜坡塑造物打疫苗于綠膿菌素測(cè)量用培養(yǎng)液（PDP）斜坡上，30～35℃塑造24小時(shí)后，觀(guān)查斜坡有沒(méi)有黑色素，若有黑色素，在試管嬰兒里加三氯甲烷3～5ml，以無(wú)菌檢測(cè)玻棒絞碎培養(yǎng)液并充足振搖。使塑造物中的黑色素徹底提純?cè)谌燃淄閮?nèi)。靜放一會(huì)兒，待三氯甲烷分層次，用塑料吸管將三氯甲烷挪到另一試管嬰兒中，添加硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（1mol／L）約1ml，振搖后靜放一會(huì)兒，如在硫酸液層內(nèi)發(fā)生淡粉色、即是陽(yáng)性反應(yīng)，無(wú)淡粉色發(fā)生為陰性反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)可以用未打疫苗的PDP瓊脂培養(yǎng)液斜坡作陰性對(duì)照，陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)理應(yīng)呈呈陰性。如培養(yǎng)液斜坡無(wú)黑色素造成，應(yīng)于室內(nèi)溫度塑造l～2天再按上法實(shí)驗(yàn)。凡經(jīng)再度檢測(cè)，綠膿菌素實(shí)驗(yàn)仍為呈陰性者應(yīng)再次下列實(shí)驗(yàn)。
6.7.3 磷酸鹽還原產(chǎn)地氣實(shí)驗(yàn)
以接種環(huán)沾取少量營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂斜坡塑造物打疫苗于磷酸鹽胨水培養(yǎng)液中，置30～35℃塑造24小時(shí)，觀(guān)查結(jié)果。假如在培養(yǎng)液內(nèi)的小倒管內(nèi)有汽體造成，即是陽(yáng)性反應(yīng)，說(shuō)明該塑造物能復(fù)原磷酸鹽，并將亞硝酸鈉溶解造成N2。小倒管中沒(méi)有氣泡者為陰性反應(yīng)。
6.7.4 42℃生長(zhǎng)發(fā)育實(shí)驗(yàn)
以接種環(huán)沾取少量營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂斜坡塑造物于0.9％無(wú)菌檢測(cè)氯化鈉溶液中，做成菌懸液。隨后將菌懸液畫(huà)線(xiàn)打疫苗于營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂斜坡上，馬上置41℃士1℃的恒溫水浴箱內(nèi)，務(wù)使全部斜坡浸入在水浴中，塑造24～48h，斜坡若有菌苔生長(zhǎng)發(fā)育者為陽(yáng)性反應(yīng)；無(wú)菌苔生長(zhǎng)發(fā)育為陰性反應(yīng)。
6.7.5 明膠液化實(shí)驗(yàn)
以接種針沾取營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂斜坡塑造物少量，穿刺接種于果膠培養(yǎng)液中，穿刺術(shù)深層應(yīng)貼近培養(yǎng)液的底端，于30～35℃塑造24小時(shí)。取下放進(jìn)0～4℃電冰箱內(nèi)10～30min。如培養(yǎng)液呈水溶液狀，即是明膠液化實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)；如果膠呈凝結(jié)狀，為陰性反應(yīng)。
本實(shí)驗(yàn)應(yīng)留意：
（1）本實(shí)驗(yàn)打疫苗前，培養(yǎng)液應(yīng)是固體，不然需將培養(yǎng)液置電冰箱內(nèi)使之凝結(jié)后，再穿刺接種。
（2）實(shí)驗(yàn)應(yīng)另外設(shè)未打疫苗病菌的陰性對(duì)照管，與實(shí)驗(yàn)管另外塑造并觀(guān)查結(jié)果。
7 結(jié)果匯報(bào)
7.1 供試品塑造物經(jīng)確認(rèn)為革蘭呈陰性鏈球菌，抗霉素實(shí)驗(yàn)及綠膿菌素實(shí)驗(yàn)皆為陽(yáng)性者，即匯報(bào)1g或1ml供試IQC出銅綠假單胞菌。
7.2 供試品塑造物抗霉素實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性，鏡檢查為革蘭呈陰性鏈球菌的塑造物，綠膿菌素實(shí)驗(yàn)呈陰性時(shí)，其磷酸鹽還原產(chǎn)地氣實(shí)驗(yàn)、42℃生長(zhǎng)發(fā)育實(shí)驗(yàn)及明膠液化實(shí)驗(yàn)皆為呈陽(yáng)性時(shí)，亦匯報(bào)1g或1ml供試IQC出銅綠假單胞菌。
7.3 凡與7.1與7.2結(jié)果不符合時(shí)，匯報(bào)1g或1ml供試品未驗(yàn)出銅綠假單胞茵。
8 常見(jiàn)問(wèn)題
8.1 銅綠假單胞菌環(huán)境污染藥物后，因生產(chǎn)工藝流程和藥品的危害，在溴代十六烷基三甲胺平板電腦上的菌體形狀可造成非典型形狀。為避免 漏驗(yàn)，在挑取疑是菌體時(shí)，宜取2～3個(gè)之上菌體，各自開(kāi)展檢測(cè)，以提升 銅綠假單胞菌的診斷率。
8.2 綠膿菌素是銅綠假單胞菌評(píng)定的關(guān)鍵特點(diǎn)，但黑色素的造成受很多要素的危害，除菌種差別及基因變異外，塑造標(biāo)準(zhǔn)是關(guān)鍵要素，溫度、培養(yǎng)液成份等皆可危害黑色素造成。培養(yǎng)液中瓊脂、蛋白胨等均應(yīng)事前檢測(cè)，采用適合知名品牌，實(shí)驗(yàn)時(shí)并且用呈陽(yáng)性菌種作對(duì)比實(shí)驗(yàn)。
（五）橙黃色鏈球菌
1 概述
橙黃色鏈球菌（Staphylococcus aureus）為鏈球菌屬中的一種，普遍遍布于大自然。氣體、土壤層、水及物件上，動(dòng)物和人肌膚及與外部互通的腔道中，也常常有本菌存有。本菌可造成多種多樣內(nèi)毒素及酶，這種毒副作用化學(xué)物質(zhì)能造成部分及全身上下生膿性發(fā)炎，比較嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展趨勢(shì)變成敗血病和膿毒血癥，是人們生膿性感柒中關(guān)鍵的病菌。本菌抵抗能力較強(qiáng)，干躁?duì)顩r下會(huì)存活數(shù)月，80℃30min的標(biāo)準(zhǔn)下行遠(yuǎn)必自生存，5％石碳酸或0.1％升汞水溶液10～15min才會(huì)被殺掉。
橙黃色鏈球菌查驗(yàn)按增菌、分離出來(lái)、純塑造、革蘭氏染色鏡檢查和血液凝結(jié)酶實(shí)驗(yàn)等流程開(kāi)展。此方法適用外敷藥物及一般滴眼劑、眼膏藥的查驗(yàn)。
2 儀器設(shè)備、機(jī)器設(shè)備及用品（見(jiàn)大腸埃希菌檢測(cè)法2）
3 標(biāo)準(zhǔn)溶液、標(biāo)示液
3.1 0.9％無(wú)菌檢測(cè)氯化鈉溶液或無(wú)菌檢測(cè)聚磷酸鹽緩沖溶液（pH7.2）（配件二3.1，3.3）
3.2 革蘭氏染色液（配件二2.4，2.10，2.16）
3.3 無(wú)菌檢測(cè)枸櫞酸鈉氯化鈉溶液（配件二2.7）
3.4 血液的制取
以無(wú)菌檢測(cè)注射針汲取殺菌的含5％枸櫞酸鈉的0.9％的氯化鈉溶液1ml，用無(wú)菌操作原則采用家兔（或羊、人）血8ml，輕輕地?cái)嚢鑾追昼?。待血夜不凝結(jié)時(shí)，緩緩放進(jìn)殺菌離心管中，抽濾（500 r／min抽濾5min），分離出來(lái)血液，用殺菌塑料吸管將血液遷移至殺菌試管嬰兒中，置電冰箱預(yù)留。臨用前務(wù)必用已經(jīng)知道血液凝結(jié)酶實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性的橙黃色鏈球菌（如橙黃色鏈球菌[CMCC(B) 26003]）檢測(cè)，證實(shí)血液達(dá)標(biāo)后，即可用以試驗(yàn)。
3.5 1％酚磺酞標(biāo)示液（配件二4.4）
4 培養(yǎng)液
4.1 營(yíng)養(yǎng)成分骨頭湯培養(yǎng)液（配件二5.1）
4.2 營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂培養(yǎng)液（配件二5.2）
4.3 亞碲磷酸鹽骨頭湯培養(yǎng)液（配件二5.15）
4.4 卵黃氧化鈉瓊脂培養(yǎng)液（配件二5.16）
4.5 甘露醇氧化鈉瓊脂培養(yǎng)液（配件二5.17）
5 對(duì)比用菌液
取橙黃色鏈球菌[CMCC(B) 26003]營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂斜坡新鮮塑造物少量，打疫苗至10ml營(yíng)養(yǎng)成分骨頭湯培養(yǎng)液中，30～35℃塑造18～24小時(shí)，用0.9％無(wú)菌檢測(cè)氯化鈉溶液按10倍增長(zhǎng)稀釋液濃度值等同于10～100cfu／ml，作陽(yáng)性對(duì)照用菌液。其菌液濃度值可在做陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)的另外用平板電腦菌落計(jì)數(shù)法測(cè)出。（見(jiàn)方式認(rèn)證用規(guī)范菌種2.4）
6 操作步驟
6.1 供試品的檢測(cè)量[見(jiàn)病菌、黃曲霉菌(酵母)記數(shù)6]
6.2 供標(biāo)準(zhǔn)溶液的制取[見(jiàn)病菌、黃曲霉菌(酵母)記數(shù)7]
6.3 增菌培養(yǎng)
取營(yíng)養(yǎng)成分肉湯（或亞碲酸鈉緩釋片肉湯）培養(yǎng)基3份，每一份100ml，1份添加10ml供試液，1份添加供試液及陽(yáng)性對(duì)照菌，1份添加與供試液相等的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液或聚磷酸鹽緩沖溶液（pH7.2）做為陰性對(duì)照，置30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)（必需時(shí)可延到48h）。陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)發(fā)育。
6.4 分離出來(lái)培養(yǎng)將以上供試品增菌培養(yǎng)液，以接種環(huán)沾取1～2環(huán)培養(yǎng)液，畫(huà)線(xiàn)打疫苗于卵黃氧化鈉瓊脂平板電腦或甘露醇氧化鈉瓊脂平板電腦上，置30～35℃培養(yǎng)24～72h。當(dāng)供試品分離出來(lái)平板電腦無(wú)菌落生長(zhǎng)發(fā)育，或有菌體生長(zhǎng)發(fā)育但有別于下列列出特點(diǎn)，可匯報(bào)為1g或1ml供試品未驗(yàn)出橙黃色鏈球菌。
表5 橙黃色鏈球菌在三種可選擇性培養(yǎng)基上菌體形狀特點(diǎn)
| 培養(yǎng)基 |
菌體形狀特點(diǎn) |
| 卵黃鈦酸異丙酯納瓊脂 |
橙黃色，環(huán)形突起，邊沿齊整，光潔潮濕，頸靜脈有溶解大豆卵磷脂后造成的乳濁圈，菌體直徑1～2毫米 |
| 甘露醇鈦酸異丙酯納瓊脂 |
橙黃色，環(huán)形突起，邊沿齊整．光潔潮濕．頸靜脈有淡黃色環(huán)。菌體直徑0.7～1毫米 |
6.5 純培養(yǎng)
當(dāng)供試品分離出來(lái)平板電腦生長(zhǎng)發(fā)育菌體與表1列出菌體特點(diǎn)類(lèi)似或疑是時(shí)，應(yīng)選擇2～3個(gè)之上菌體，各自用接種針，輕輕地沾取菌體管理中心表層培養(yǎng)物，打疫苗于營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂斜坡上，于30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)，取營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂斜坡培養(yǎng)物作革蘭氏染色、鏡檢查及打疫苗營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂肉湯于30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)做血液凝結(jié)酶實(shí)驗(yàn)。
6.6 革蘭氏染色、鏡檢查
6.6.1 革蘭氏染色（見(jiàn)大腸埃希菌檢測(cè)法6.5）
6.6.2 鏡檢查橙黃色鏈球菌為革蘭呈陽(yáng)性革蘭陰性桿菌，無(wú)芽胞，一般不造成莢膜。排序呈不規(guī)律的紅提狀，也可以呈單獨(dú)、成雙成對(duì)或短網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)排序。
6.7 血液凝結(jié)酶實(shí)驗(yàn)
試管嬰兒法：取無(wú)菌試管嬰兒（11mm×100毫米）3支，各添加血液和0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液（1:1）0.5ml，1支添加瓊脂斜坡培養(yǎng)物菌懸液（或被檢菌的營(yíng)養(yǎng)成分肉湯培養(yǎng)液）0.5ml，其他2支對(duì)著干照料：1支添加橙黃色鏈球菌[CMCC(B) 26003]培養(yǎng)物菌懸液或營(yíng)養(yǎng)成分肉湯培養(yǎng)液0.5ml做為陽(yáng)性對(duì)照；另一支添加營(yíng)養(yǎng)成分肉湯或0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液0.5ml作陰性對(duì)照。三管另外置37℃水浴或控溫培養(yǎng)箱，3h后逐漸查驗(yàn)，之后每過(guò)適度時(shí)間觀(guān)查一次，直到24小時(shí)。查驗(yàn)時(shí)，輕輕地將試管嬰兒歪斜（姿勢(shì)勿大），認(rèn)真觀(guān)察，陰性對(duì)照管血液流動(dòng)性輕松，陽(yáng)性對(duì)照管血液呈凝結(jié)狀，實(shí)驗(yàn)管呈凝結(jié)者為陽(yáng)性反應(yīng)；不凝結(jié)為陰性反應(yīng)。陽(yáng)性對(duì)照管和陰性對(duì)照管一切一管不符合規(guī)定時(shí)，應(yīng)另制取血液，再次實(shí)驗(yàn)。
7 結(jié)果分辨
假如革蘭氏染色結(jié)果清楚靠譜（必需時(shí)加做已經(jīng)知道革蘭氏染色結(jié)果的病菌開(kāi)展上色質(zhì)量管理），凝結(jié)酶實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)呈呈陰性，陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性結(jié)果，供試品培養(yǎng)物按以下工作方案或解決：
7.1 疑是菌革蘭氏染色呈陽(yáng)性革蘭陰性桿菌，血液凝結(jié)酶實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)者，匯報(bào)1g或1ml供試IQC出橙黃色鏈球菌（少量菌種很有可能并不是橙黃色鏈球菌只是鏈球菌屬的別的菌苗）。
7.2 革蘭氏染色鏡檢查并不是革蘭呈陽(yáng)性革蘭陰性桿菌，或血液凝結(jié)酶實(shí)驗(yàn)陰性反應(yīng)，匯報(bào)1g或1ml供試品未驗(yàn)出橙黃色鏈球菌。
7.3 陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)發(fā)育，實(shí)驗(yàn)結(jié)果失效。
7.4 陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)呈呈陰性結(jié)果，理應(yīng)加做認(rèn)證實(shí)驗(yàn)，調(diào)查檢品是不是有抗菌特異性。
8 常見(jiàn)問(wèn)題
8.1 橙黃色鏈球菌在以上二種分離出來(lái)培養(yǎng)基上的典型性菌體為橙黃色。但因?yàn)槭芩幤肺：蚍堑湫途N存有，也可以呈橘黃色、杏黃色或乳白色。做操縱菌查驗(yàn)，對(duì)非典型菌體也必須開(kāi)展凝結(jié)酶實(shí)驗(yàn)做橙黃色鏈球菌的篩選，防止漏驗(yàn)橙黃色鏈球菌。培養(yǎng)基儲(chǔ)放時(shí)間和培養(yǎng)時(shí)間危害黑色素造成，故培養(yǎng)基應(yīng)新鮮配置。培養(yǎng)時(shí)間宜48h之上。
8.2 假如應(yīng)用干躁培養(yǎng)基，應(yīng)按使用說(shuō)明配置，留意pH值是不是符合要求，必需時(shí)要校準(zhǔn)pH后殺菌應(yīng)用。
8.3 血液凝結(jié)酶實(shí)驗(yàn)運(yùn)用新鮮培養(yǎng)物及新鮮血液。如用老舊培養(yǎng)物及血液（游離脂肪酸常已進(jìn)行析出）易造成假陰性反應(yīng)。除此之外，觀(guān)查結(jié)果時(shí)不必?fù)u晃試管嬰兒，因凝結(jié)前期稠狀易毀壞，造成假陰性實(shí)驗(yàn)。
8.4 鏈球菌屬在新版本《Bergey手冊(cè)》中國(guó)共產(chǎn)黨載于為28種，在微生物評(píng)定中現(xiàn)階段運(yùn)用較多的2003年出版發(fā)行的第八版《美國(guó)臨床微生物手冊(cè)》收錄于35個(gè)菌苗，44個(gè)菌型。普遍有橙黃色鏈球菌與外皮鏈球菌、腐生鏈球菌3種?？蓞⒖枷卤黹_(kāi)展評(píng)定。在其中又以橙黃色鏈球菌和外皮鏈球菌的辨別更為關(guān)鍵。
表6 3種鏈球菌的關(guān)鍵特性
| 特性 |
橙黃色鏈球菌 |
外皮鏈球菌 |
腐生鏈球菌 |
| 菌體黑色素 |
關(guān)鍵為橙黃色 |
關(guān)鍵為乳白色 |
關(guān)鍵為杏黃色 |
| 尺寸（菌體直徑） |
0.8～1.0Mm |
0.5～1.5毫米 |
0.5～1.5毫米 |
| α溶血癥內(nèi)毒素 |
＋ |
－／非常少＋ |
－ |
| 甘露醇 |
|
|
|
| 需氧 |
＋ |
d |
d |
| 厭氧發(fā)酵 |
＋ |
－ |
－ |
| 凝結(jié)酶 |
＋ |
－ |
－ |
| 卵黃反映 |
＋ |
－ |
－ |
| 耐高溫DNA酶 |
＋ |
－ |
－ |
| 對(duì)新生兒菌素敏感度 |
S |
S |
R |
| 噬菌體分析 |
大部分能分析 |
不可以分析 |
不可以分析 |
| A蛋白質(zhì) |
＋ |
－ |
－ |
| 高致病 |
強(qiáng) |
弱或無(wú) |
無(wú) |
d結(jié)果不確定性，S比較敏感，R抗藥性
8.5 現(xiàn)階段商業(yè)化的橙黃色鏈球菌檢測(cè)試劑好幾家微生物菌種有關(guān)中藥制劑企業(yè)有銷(xiāo)售，實(shí)驗(yàn)試劑具備不錯(cuò)的可靠性、精確性。商業(yè)化的檢測(cè)試劑理應(yīng)在適度的標(biāo)準(zhǔn)下儲(chǔ)存，在有效期限內(nèi)運(yùn)用。
（六）梭菌
1 概述
梭菌屬（Clostridium）以往稱(chēng)之為梭狀枯草芽孢菌屬，菌體1um×5um上下的革蘭呈陽(yáng)性鏈球菌，能產(chǎn)生芽胞。芽胞多超過(guò)菌體的總寬，病菌澎漲呈梭形，故稱(chēng)梭狀枯草芽孢菌。該菌屬中關(guān)鍵病菌有脹氣莢膜梭菌(C.perfringens)、破傷風(fēng)梭菌（C.tetani）、肉毒梭菌（C.botulinum）和艱難梭菌（C.difficile），均能造成明顯的外毒素使動(dòng)物和人發(fā)病。因而，針對(duì)一些用以陰道內(nèi)、外傷、潰爛的藥物，務(wù)必操縱梭菌。
查驗(yàn)梭菌的方式主要是增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)和鏡檢查形狀觀(guān)查，必需時(shí)做分離出來(lái)培養(yǎng)后再次評(píng)定。
2 儀器設(shè)備、機(jī)器設(shè)備及用品
2.1 玻璃容器
試管嬰兒（30mm×200mm）等。清洗整潔，沒(méi)有殘留抑菌化學(xué)物質(zhì)，捆扎后，殺菌預(yù)留[見(jiàn)病菌、黃曲霉菌(酵母)記數(shù)]。
2.2 天平秤、離心脫水機(jī)、光學(xué)顯微鏡、髙壓滅菌設(shè)備、干燥烘箱[見(jiàn)病菌、黃曲霉菌(酵母)記數(shù)]。
2.2.1 天平秤、髙壓滅菌設(shè)備、干燥烘箱等應(yīng)按時(shí)開(kāi)展校檢。
2.2.2 厭氧發(fā)酵培養(yǎng)袋、箱（罐）等（有產(chǎn)品供貨），經(jīng)檢測(cè)后采用。
2.3 清潔試驗(yàn)室或超凈工作臺(tái)[見(jiàn)病菌、黃曲霉菌(酵母)記數(shù)2.1.1]。
2.4 手術(shù)治療鑷、手術(shù)治療剪及抽樣匙，應(yīng)嚴(yán)實(shí)捆扎，殺菌預(yù)留。
3 標(biāo)準(zhǔn)溶液
3.1 革蘭氏染色液（配件二2.10，2.16，2.4）
3.2 厭氧發(fā)酵顯色劑（配件二4.8）
3.3 3％雙氧水水溶液
3.4 75％乙醇溶液
3.5 碘酊水溶液或碘伏消毒液
3.6 0.9％無(wú)菌檢測(cè)氯化鈉溶液（配件二3.1）
3.7 苯扎溴銨（1:1000）水溶液
4 培養(yǎng)液
4.1 硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)液（配件二5.33）
4.2 梭菌增菌培養(yǎng)液（配件二5.29）
4.3 澳大利亞瓊脂培養(yǎng)液（含青霉素50mg／L和沒(méi)有青霉素）（配件二5.30）
5 對(duì)比用菌液
生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC(B) 64941]。
菌液制取 取生孢梭菌打疫苗至12ml硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)液中，置30～35℃塑造18～24小時(shí)，用0.9%無(wú)菌檢測(cè)氯化鈉溶液做成1ml含10～100cfu的菌液。生孢梭菌規(guī)范菌液記數(shù)可用1ml含100～1000cfu的菌液0.1ml施膠于澳大利亞瓊脂培養(yǎng)液平板電腦置厭氧發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)下塑造48～72h記數(shù)；還可以取1ml含10～100cfu的菌液1ml打疫苗于不少于12ml硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)液中，混勻，置30～35℃塑造18～20h記數(shù)在其中的小燈籠狀菌團(tuán)，一般狀況時(shí)該小燈籠狀菌團(tuán)數(shù)與平板電腦記數(shù)菌體數(shù)非常。[見(jiàn)方式認(rèn)證2.4]
生孢梭菌菌苗的儲(chǔ)存可用其硫乙醇酸鹽液體塑造物攪拌、凍存管散裝、低溫儲(chǔ)存（如－80℃），用時(shí)取下當(dāng)然解除凍結(jié)、經(jīng)硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)液再生、促根，制取新鮮塑造物應(yīng)用。
6 操作步驟
6.1 不一樣制劑試品的前解決
6.1.1 藥粉去除包裝，立即稱(chēng)量規(guī)定量的試品就可以。
6.1.2 膠襄去除包裝，連殼一起稱(chēng)量規(guī)定量試品。
6.1.3 軟膏劑及栓劑稱(chēng)量試品20g，按病菌、黃曲霉菌、(酵母)記數(shù)6.23要求的適合方式乳狀液，乳狀液后添加加熱至45℃的0.9％無(wú)菌檢測(cè)氯化鈉溶液，做成1:20供標(biāo)準(zhǔn)溶液。
6.2 增菌塑造
6.2.1 厭氧發(fā)酵塑造設(shè)備的提前準(zhǔn)備除產(chǎn)品厭氧發(fā)酵塑造袋、箱、罐按使用說(shuō)明書(shū)規(guī)定提前準(zhǔn)備外，試驗(yàn)室也可以用真空干燥器、標(biāo)本瓶或別的適合器皿取代應(yīng)用，可采用以下一種方式制取厭氧發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)：
6.2.1.1 冷觸媒法 臨用前，取試管嬰兒或別的適合器皿3支，1支稱(chēng)入硼氫化鈉0.22g（以厭氧發(fā)酵塑造器皿容量1L計(jì)），1支稱(chēng)取枸櫞酸0.33g、碳酸氫納0.37g，另1支放進(jìn)經(jīng)活性的鈀粒約1g，與打疫苗后的供試品塑造管（或平板電腦）及厭氧發(fā)酵顯色劑管1支，另外放置厭氧發(fā)酵塑造器皿內(nèi)，隨后各放水5ml于前2立管（或器皿）中，快速密封性器皿蓋。鈀粒為遮蓋鈀的三氧化二鋁的球形或條形顆粒物（有商品出售），用前需經(jīng)160℃干烤1h，或在加熱爐上燒灼5min使其活性。因?yàn)槊坑?次便喪失催化反應(yīng)性，因而，再度應(yīng)用時(shí)要按上法活性后才能應(yīng)用。將鈀粒多個(gè)置室內(nèi)溫度水里，附帶很多汽泡者為特異性?xún)?yōu)良，可立即應(yīng)用。此方法可做為鈀粒的特異性查驗(yàn)。
6.2.1.2 焦性沒(méi)食子酸法用前，取細(xì)胞培養(yǎng)皿或別的適合器皿1支，添加焦性沒(méi)食子酸20g及無(wú)水碳酸鈉5G（以厭氧發(fā)酵器皿容量1L計(jì)），與打疫苗后的供試品塑造管（或平板電腦）及厭氧發(fā)酵顯色劑管1支另外放置厭氧發(fā)酵器皿內(nèi)，快速密封性器皿蓋。
6.2.2 增菌塑造 取供標(biāo)準(zhǔn)溶液10ml（等同于供試品1g、1ml）4份，其中2份置80℃隔熱保溫10min后快速制冷。以上4份供標(biāo)準(zhǔn)溶液立即或解決后各自打疫苗至100ml的梭菌增菌培養(yǎng)液中，其中2份（立即1份，解決后1份）梭菌增菌塑造管內(nèi)各自添加陽(yáng)性對(duì)照菌（10～100cfu）。置厭氧發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)下塑造48h。
6.3 分離出來(lái)塑造取以上每一塑造物0.2ml，各自擦抹打疫苗于含青霉素的澳大利亞瓊脂培養(yǎng)液平板電腦上，置厭氧發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)下塑造48～72h。若供試品平板電腦上無(wú)菌檢測(cè)落生長(zhǎng)發(fā)育，判供樣品未驗(yàn)出梭菌；若供試品平板電腦上面有菌體生長(zhǎng)發(fā)育，應(yīng)選擇2～3個(gè)菌體各自開(kāi)展革蘭氏染色和酶活性實(shí)驗(yàn)。
6.4 革蘭氏染色鏡檢查取疑是菌體玻片，作革蘭氏染色、鏡檢查，觀(guān)查上色及菌體特點(diǎn)。本菌形狀特點(diǎn)比較典型性。塑造后產(chǎn)生的芽胞，初呈“火柴頭”狀橢圓狀，進(jìn)而彭大呈球型，在菌體尾端如鼓槌狀。塑造時(shí)間至72h之上時(shí)，菌體可自溶而消退，僅見(jiàn)分散的芽胞囊，一般上色時(shí)呈圓形狀。上色鏡檢查有橢圓狀至球型的芽胞，超過(guò)菌體，著生在菌體中間、次端或頂部，為梭菌典型性形狀。
6.5 酶活性實(shí)驗(yàn) 加一滴3％雙氧水水溶液至瓊脂表層的單獨(dú)分散化的菌體，或遷移至蓋玻片上的菌體上。有汽泡產(chǎn)生表明酶活性反映呈陽(yáng)性，梭菌應(yīng)成呈陰性結(jié)果?？梢杂每莶菘莶菅挎呔鰹殛?yáng)性反應(yīng)對(duì)比菌。
7 結(jié)果分辨
若以上異常菌體為革蘭呈陽(yáng)性梭菌，有或無(wú)橢圓狀或球型的芽胞。酶活性實(shí)驗(yàn)呈陰性，判供試IQC出梭菌，不然判供樣品未驗(yàn)出梭菌。
8 常見(jiàn)問(wèn)題
8.1 實(shí)際操作時(shí)勿損害肌膚，若有損害，應(yīng)該馬上注入破傷風(fēng)針抗毒素，防止感柒。
8.2 凡含有活菌及內(nèi)毒素的器材，應(yīng)在完全殺菌后才可清洗。
（七）白色念珠菌
1 概述
白色念珠菌（Candida albicans）別名白假絲酵母菌（Saccharomyces albicaus）屬假絲酵母菌屬（Saccharomyces）。白色念珠茵是條件致病菌，是醫(yī)藥學(xué)全身病菌感染病的關(guān)鍵構(gòu)成之一，一旦感柒，常可造成心內(nèi)膜炎、肺部感染、紅屁屁、嬰兒鵝口瘡、陰道炎癥、心肌炎及敗血病等。
白色念珠菌菌體細(xì)胞正圓形或橢圓狀，直徑為3～6um，革蘭氏染色為呈陽(yáng)性，但菌體上色不勻稱(chēng)，以發(fā)芽方法繁育，在適合的培養(yǎng)液上面有芽生胞子及假真菌生長(zhǎng)發(fā)育，在假真菌間其尾端產(chǎn)生厚膜胞子。白色念珠菌具備β-氟苯半乳甘酶，可降解性NGL，使對(duì)一硝基苯酚分散，在偏堿標(biāo)準(zhǔn)下著色。
白色念珠菌普遍遍布于土壤層、水和空氣中，現(xiàn)階段世界各國(guó)的藥物、食品安全標(biāo)準(zhǔn)已把白色念珠菌做為微生物檢驗(yàn)中酵母的意味著菌，因而有一些藥物根據(jù)給藥途徑和制劑將白色念珠菌做為操縱菌是十分必需的。
2 實(shí)驗(yàn)器械及標(biāo)準(zhǔn)
2.1 機(jī)器設(shè)備及容器
生化培養(yǎng)箱（23～28℃）、恒溫培養(yǎng)箱（30～35℃）、水浴鍋、光學(xué)顯微鏡、三角燒瓶、塑料吸管、細(xì)胞培養(yǎng)皿等。
2.2 規(guī)范菌種
白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F) 98001]。
菌液制取 取新鮮白色念珠菌菌苗打疫苗至10ml沙氏葡萄糖水液體培養(yǎng)基中，30～35℃塑造24～兩天，用0.9％無(wú)菌檢測(cè)鹽水稀釋液至含菌10～100cfu／ml。菌液可以用沙氏葡萄糖水瓊脂培養(yǎng)液平板電腦記數(shù)測(cè)量。
2.3 培養(yǎng)液
沙氏葡萄糖水液體培養(yǎng)基（配件二5.35）
沙氏葡萄糖水瓊脂培養(yǎng)液（配件二5.36）
滴蟲(chóng)著色培養(yǎng)液（荷蘭CHROMAGAR企業(yè)）[配件二5.37]
1％聚山梨酯80－玉米面粉瓊脂培養(yǎng)液（配件二5.38）
3 實(shí)驗(yàn)實(shí)際操作
取供標(biāo)準(zhǔn)溶液10ml（等同于供試品1g、1ml、10cm2）立即或解決后打疫苗至適當(dāng)（不少于100m1）的沙氏葡萄糖水骨頭湯培養(yǎng)液中，塑造24～48 h。取以上塑造物畫(huà)線(xiàn)打疫苗于沙氏葡萄糖水瓊脂培養(yǎng)液平板電腦上，經(jīng)30～35℃，塑造24～48h（必需時(shí)增加至72h）。
白色念珠菌在沙氏葡萄糖水瓊脂培養(yǎng)液上生長(zhǎng)發(fā)育的菌體呈奶白色少許淺黃色，表層光潔有濃酵母菌味道，塑造時(shí)間稍久則菌體擴(kuò)大，色調(diào)變深、材質(zhì)發(fā)硬或者有皺摺。
若平板電腦上無(wú)菌檢測(cè)落生長(zhǎng)發(fā)育或生長(zhǎng)發(fā)育的菌體與以上菌體形狀特點(diǎn)不符合，判供樣品未驗(yàn)出白色念珠菌。
如平板電腦上生長(zhǎng)發(fā)育的菌體與以上菌體形狀特點(diǎn)相符合或疑是，應(yīng)選擇2～3個(gè)菌體各自打疫苗至滴蟲(chóng)著色培養(yǎng)液平板電腦上，經(jīng)30～35℃塑造24～48h（必需時(shí)增加至72h）。若平板電腦上無(wú)翠綠色或綠色的菌體生長(zhǎng)發(fā)育，判供樣品未驗(yàn)出白色念珠菌。
4 確定實(shí)驗(yàn)
若平板電腦上生長(zhǎng)發(fā)育的菌體為翠綠色或綠色，挑取相符合或疑是的菌體打疫苗于1％聚山梨酯80－苞米瓊脂培養(yǎng)液上，塑造24～48h。取塑造物開(kāi)展上色，鏡檢查及芽管實(shí)驗(yàn)。
芽管實(shí)驗(yàn) 挑取1％聚山梨酯80－苞米瓊脂培養(yǎng)液上的塑造物，打疫苗于加上一滴血清蛋白的蓋玻片上，蓋上蓋玻片，置潮濕的平皿內(nèi)，置35～37℃塑造1～3h，置顯微鏡下觀(guān)查，可看到由胞子長(zhǎng)出簡(jiǎn)短芽管。
若以上疑是菌為非革蘭陽(yáng)性菌，光學(xué)顯微鏡末見(jiàn)厚膜胞子、假真菌、芽管，判供樣品未驗(yàn)出白色念珠菌。
三、培養(yǎng)液適用范圍查驗(yàn)
1 簡(jiǎn)述
培養(yǎng)液品質(zhì)是危害微生物檢驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵步驟。記數(shù)測(cè)量用培養(yǎng)液的促生長(zhǎng)發(fā)育工作能力是微生物限度查驗(yàn)結(jié)果分辨的關(guān)鍵影響因素，操縱菌查驗(yàn)用培養(yǎng)液也很有可能因?yàn)槠浯偕L(zhǎng)發(fā)育工作能力、標(biāo)示工作能力、抑止工作能力的差別，進(jìn)而對(duì)菌體色調(diào)、形狀等指標(biāo)值存有很大差別，危害結(jié)果分辨的普遍性。
培養(yǎng)液適用范圍查驗(yàn)是根據(jù)檢測(cè)用培養(yǎng)液與對(duì)比培養(yǎng)液的較為，以陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)發(fā)育情況或特點(diǎn)來(lái)點(diǎn)評(píng)分辨檢測(cè)用培養(yǎng)液是不是合乎檢測(cè)規(guī)定。
微生物限度查驗(yàn)用培養(yǎng)液關(guān)鍵分成病菌、黃曲霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)測(cè)量用培養(yǎng)液和操縱菌查驗(yàn)用培養(yǎng)液兩一部分。2010版《中國(guó)藥典》微生物限度檢測(cè)法中載于了“適用范圍查驗(yàn)”對(duì)培養(yǎng)液品質(zhì)開(kāi)展操縱。
2 培養(yǎng)液適用范圍查驗(yàn)試驗(yàn)的一般規(guī)定
2.1 培養(yǎng)液適用范圍查驗(yàn)應(yīng)用領(lǐng)域
2010版《中國(guó)藥典》要求微生物限度查驗(yàn)中制成品培養(yǎng)液、由脫干培養(yǎng)液或按藥方配置的培養(yǎng)液均應(yīng)開(kāi)展培養(yǎng)液適用范圍查驗(yàn)。
培養(yǎng)液適用范圍查驗(yàn)實(shí)驗(yàn)可用以明確試驗(yàn)室所應(yīng)用培養(yǎng)液（包含購(gòu)買(mǎi)的不一樣生產(chǎn)批號(hào)的制成品培養(yǎng)液、不一樣生產(chǎn)批號(hào)的脫干培養(yǎng)液粉劑、按藥方自主配置培養(yǎng)液常用不一樣批號(hào)的原料等）、制取程序流程（包含水體操縱、配置方式、殺菌程序流程等）、儲(chǔ)存標(biāo)準(zhǔn)（溫度、環(huán)境濕度、時(shí)間及盛放培養(yǎng)液的器皿標(biāo)準(zhǔn)等）等是不是達(dá)到微生物限度查驗(yàn)用規(guī)定。即以上危害培養(yǎng)液品質(zhì)的各關(guān)鍵環(huán)節(jié)應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)液適用范圍查驗(yàn)實(shí)驗(yàn)明確，假如在其中有任一基準(zhǔn)點(diǎn)產(chǎn)生變化應(yīng)再次開(kāi)展培養(yǎng)液適用范圍查驗(yàn)?？墒俏：ε囵B(yǎng)液品質(zhì)的重要基準(zhǔn)點(diǎn)的轉(zhuǎn)變 應(yīng)把握在微生物菌種試驗(yàn)室質(zhì)量管理的一般標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)（見(jiàn)2.2），超出一般標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)液是不是還能達(dá)到微生物限度查驗(yàn)用，沒(méi)法根據(jù)培養(yǎng)液適用范圍查驗(yàn)明確。
當(dāng)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)異常，或試驗(yàn)室質(zhì)量管理必須，也可根據(jù)培養(yǎng)液適用范圍查驗(yàn)出示一定根據(jù)。
總而言之，培養(yǎng)液適用范圍查驗(yàn)是在一切正常標(biāo)準(zhǔn)下有關(guān)培養(yǎng)液品質(zhì)的試驗(yàn)室控制方法，并不一定在每一次實(shí)際的微生物限度查驗(yàn)試品檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)主題活動(dòng)上都務(wù)必另外開(kāi)展培養(yǎng)液適用范圍查驗(yàn)實(shí)驗(yàn)，但每一次微生物菌種查驗(yàn)常用培養(yǎng)液均應(yīng)歷經(jīng)適用范圍查驗(yàn)。
2.2 微生物限度查驗(yàn)用培養(yǎng)液質(zhì)量管理的一般標(biāo)準(zhǔn)
2.2.1 不一樣藥方培養(yǎng)液的取代應(yīng)用不可以根據(jù)培養(yǎng)液適用范圍實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)易明確。
2.2.2 培養(yǎng)液適用范圍查驗(yàn)不可以替代經(jīng)銷(xiāo)商或別的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定對(duì)培養(yǎng)液的有效期限、儲(chǔ)存標(biāo)準(zhǔn)、制取方式等的更嚴(yán)苛的要求。
2.2.3 要是沒(méi)有獨(dú)特要求，培養(yǎng)液配置選用純凈水或純水系統(tǒng)均可，但應(yīng)選用一定對(duì)策多方面檢驗(yàn)操縱，如純凈水應(yīng)核查pH是不是為5～7；選用離子交換制取的純水系統(tǒng)，阻值應(yīng)不小于2MΩ等。
2.2.4 盡可能臨用現(xiàn)配。培養(yǎng)基滅菌后在能取下的前提條件下，盡早取下，切勿在壓力鍋內(nèi)留宿留存；固態(tài)培養(yǎng)基滅菌或溶化后，溶化情況置放不可超出8h；一般預(yù)制構(gòu)件培養(yǎng)液可置清潔自然環(huán)境2～25℃儲(chǔ)存，但不可超出二十一天；固態(tài)瓊脂培養(yǎng)液熔融再應(yīng)用應(yīng)不超過(guò)一次。
2.2.5 粉劑培養(yǎng)液或培養(yǎng)液原材料霉變不可再用；預(yù)制構(gòu)件培養(yǎng)液存儲(chǔ)全過(guò)程中發(fā)覺(jué)混濁、掉色、長(zhǎng)菌、比較嚴(yán)重脫干等轉(zhuǎn)變 不可再用。
2.3 對(duì)比培養(yǎng)液
對(duì)比培養(yǎng)液應(yīng)根據(jù)嚴(yán)苛的品質(zhì)科學(xué)研究和操縱，具有特性平穩(wěn)、品質(zhì)出色的特性。對(duì)比培養(yǎng)液做為一種規(guī)范實(shí)驗(yàn)試劑，應(yīng)具有靠譜的來(lái)源于和品質(zhì)確保。
2.4 培養(yǎng)液適用范圍查驗(yàn)指標(biāo)值及常見(jiàn)方式
2.4.1 查驗(yàn)指標(biāo)值：促生長(zhǎng)發(fā)育工作能力、標(biāo)示工作能力、抑止工作能力。
2.4.2 常見(jiàn)方式：立即打疫苗法、澆碟法、表層打疫苗法（施膠法）。
2.4.3 液體培養(yǎng)基一般 選用立即打疫苗測(cè)定方法以上3種指標(biāo)值，打疫苗時(shí)要留意接種量不可超出培養(yǎng)液容積的10％。固體培養(yǎng)基選用澆碟法和表層打疫苗測(cè)定方法以上指標(biāo)值。選用澆碟法調(diào)查固體培養(yǎng)基時(shí)，為了更好地確保抽樣的平行面性，平行測(cè)定兩皿求平均數(shù)；選用表層打疫苗法（施膠法）調(diào)查固體培養(yǎng)基時(shí)，表層打疫苗菌液不超過(guò)0.2ml／皿，盡可能操縱在0.1ml／皿，確保抽樣間的平行面性，平行測(cè)定兩皿觀(guān)查結(jié)果。
3 記數(shù)培養(yǎng)液的適用范圍查驗(yàn)
微生物限度查驗(yàn)中記數(shù)用培養(yǎng)液有3種，營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂、玫紅鈉瓊脂和酵母菌浸取粉葡萄糖水瓊脂。
3.1 記數(shù)培養(yǎng)液適用范圍查驗(yàn)實(shí)驗(yàn)用菌種
大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B) 44102]
橙黃色鏈球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B) 26003]
枯草枯草芽孢菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B) 63501]
白色念珠茵（Candida albicans）[CMCC(F) 98001]
黑曲霉菌（Aspergillus niger）[CMCC(F) 98003]
菌種的塑造及菌液制取同微生物限度查驗(yàn)方式認(rèn)證。
3.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程
3.2.1 培養(yǎng)液制取按照規(guī)定程序流程新鮮配置營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂（被檢培養(yǎng)液和對(duì)比培養(yǎng)液）、玫紅鈉瓊脂（被檢培養(yǎng)液和對(duì)比培養(yǎng)液）及其酵母菌浸取粉胨葡萄糖水瓊脂（被檢培養(yǎng)液和對(duì)比培養(yǎng)液），殺菌儲(chǔ)備用。
3.2.2 營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂培養(yǎng)液取七個(gè)無(wú)菌檢測(cè)平皿，各自打疫苗大腸埃希菌、橙黃色鏈球菌、枯草枯草芽孢菌各2皿，每皿打疫苗1ml菌液（含菌50～100cfu），另一平皿不打疫苗菌做為空白試驗(yàn)，竭盡對(duì)比營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂培養(yǎng)液，攪拌，凝結(jié)后于30～35℃顛倒塑造48h，記數(shù)；被檢培養(yǎng)液同法實(shí)際操作。
3.2.3 玫紅鈉瓊脂培養(yǎng)液取五個(gè)無(wú)菌檢測(cè)平皿，各自打疫苗白色念珠菌、黑曲霉菌各2皿；每皿打疫苗1ml菌液（含菌50～100cfu)，另一平皿不打疫苗菌做為空白試驗(yàn)，竭盡對(duì)比玫紅鈉瓊脂培養(yǎng)液，攪拌，凝結(jié)后于顛倒塑造72h，記數(shù)；被檢培養(yǎng)液同法實(shí)際操作。
3.2.4 酵母菌浸取粉胨葡萄糖水瓊脂培養(yǎng)液取3個(gè)無(wú)菌檢測(cè)平皿，各自打疫苗白色念珠菌2皿，每皿打疫苗1ml菌液（含菌50～100cfu），另一平皿不打疫苗菌做為空白試驗(yàn)，竭盡對(duì)比酵母菌浸取粉胨葡萄糖水瓊脂培養(yǎng)液，攪拌，凝結(jié)后顛倒塑造72h，記數(shù)；被檢培養(yǎng)液同法實(shí)際操作。
3.3 結(jié)果分辨
若被檢培養(yǎng)液上的菌體平均值不小于對(duì)比培養(yǎng)液上的菌體平均值的70％，且菌體形狀、尺寸應(yīng)與對(duì)比培養(yǎng)液上的菌體一致，則分辨該培養(yǎng)液的適用范圍查驗(yàn)符合要求。
4 操縱菌查驗(yàn)用培養(yǎng)液適用范圍查驗(yàn)
操縱菌查驗(yàn)用制成品培養(yǎng)液、由脫干培養(yǎng)液或按培養(yǎng)液藥方配備的培養(yǎng)液均應(yīng)查驗(yàn)。檢查項(xiàng)目包含培養(yǎng)液的促生長(zhǎng)發(fā)育、標(biāo)示和抑止特點(diǎn)工作能力。
4.1 記數(shù)培養(yǎng)液適用范圍查驗(yàn)實(shí)驗(yàn)用菌種
大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B) 44102]
橙黃色鏈球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B) 26003]
乙型肝炎副傷寒沙門(mén)菌（Salmonella paratyphi B）[CMCC(B) 50094]
銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B) 10104]
生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC(B) 64941]
白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F) 98001]
菌種的塑造及菌液制取同微生物限度查驗(yàn)方式認(rèn)證。
4.2 各種各樣培養(yǎng)液必須檢測(cè)的工作能力及分辨指標(biāo)值
液體培養(yǎng)基促生長(zhǎng)發(fā)育工作能力查驗(yàn)：取不超100cfu的實(shí)驗(yàn)菌各自打疫苗于被檢培養(yǎng)液和對(duì)比培養(yǎng)液中，在相對(duì)應(yīng)操縱菌查驗(yàn)要求的塑造溫度（30～35℃）及最短培養(yǎng)液時(shí)間下塑造。增菌培養(yǎng)液多見(jiàn)回應(yīng)液體培養(yǎng)基，與對(duì)比培養(yǎng)液較為，被檢培養(yǎng)液中實(shí)驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)發(fā)育優(yōu)良，主要表現(xiàn)為液體培養(yǎng)基變混濁。
固體培養(yǎng)基促生長(zhǎng)發(fā)育工作能力查驗(yàn)：取實(shí)驗(yàn)菌液0.1ml（含菌數(shù)50～100cfu）各自施膠于被檢培養(yǎng)液和對(duì)比培養(yǎng)液上，在相對(duì)應(yīng)操縱菌查驗(yàn)要求的塑造溫度（30～35℃）及最短培養(yǎng)液時(shí)間下塑造。
與對(duì)比培養(yǎng)液較為，被檢培養(yǎng)液與對(duì)比培養(yǎng)液上生長(zhǎng)發(fā)育的菌體尺寸、形狀特點(diǎn)應(yīng)一致。
液體培養(yǎng)基標(biāo)示工作能力查驗(yàn)：取不超100cfu的實(shí)驗(yàn)菌各自打疫苗于被檢培養(yǎng)液和對(duì)比培養(yǎng)液中，在相對(duì)應(yīng)操縱菌查驗(yàn)要求的塑造溫度（30～35℃）及最短培養(yǎng)液時(shí)間下塑造。與對(duì)比培養(yǎng)液管較為，被檢培養(yǎng)液中實(shí)驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)發(fā)育狀況／顯色劑反映等應(yīng)與對(duì)比培養(yǎng)液一致。
固態(tài)養(yǎng)基標(biāo)示工作能力查驗(yàn)：取實(shí)驗(yàn)菌液0.1ml（含菌不超100cfu）各自施膠于被檢培養(yǎng)液和對(duì)比培養(yǎng)液上，在相對(duì)應(yīng)操縱菌查驗(yàn)要求的塑造溫度（30～35℃）及培養(yǎng)液時(shí)間下塑造。被檢培養(yǎng)液上實(shí)驗(yàn)菌的茵落形狀特點(diǎn)、菌體色調(diào)及顯色劑反映狀況應(yīng)與對(duì)比培養(yǎng)液一致。
培養(yǎng)液抑止工作能力查驗(yàn)：取不超100cfu的實(shí)驗(yàn)菌各自打疫苗于液態(tài)被檢培養(yǎng)液和對(duì)比培養(yǎng)液，取實(shí)驗(yàn)菌0.1ml液（不超100cfu）各自施膠于固態(tài)被檢培養(yǎng)液和對(duì)比培養(yǎng)液，在相對(duì)應(yīng)操縱菌查驗(yàn)要求的塑造溫度（30～35℃）及最多培養(yǎng)液時(shí)間下塑造，實(shí)驗(yàn)菌應(yīng)不可生長(zhǎng)發(fā)育。
4.3 操縱菌查驗(yàn)用培養(yǎng)液能力測(cè)評(píng)目錄（表7）
操縱菌查驗(yàn)涉及到的21種培養(yǎng)液，特性各不相同。報(bào)表中簡(jiǎn)述培養(yǎng)液查驗(yàn)的實(shí)際新項(xiàng)目，實(shí)際操作流程在之后表明。
表7 操縱菌查驗(yàn)用培養(yǎng)液適用范圍檢查項(xiàng)目、菌種及分辨指標(biāo)值
| 培養(yǎng)液 |
檢測(cè)菌種 |
檢測(cè)特點(diǎn) |
檢測(cè)指標(biāo)值 |
| 膽鹽乳清蛋白培養(yǎng)液 |
大腸埃希菌 |
促生長(zhǎng)發(fā)育工作能力 |
混濁 |
| 銅綠假單胞菌 |
混濁 |
||
| 橙黃色鏈球菌 |
抑止工作能力 |
末見(jiàn)混濁 |
|
| MUG培養(yǎng)液 |
大腸埃希菌 |
促生長(zhǎng)發(fā)育工作能力 |
混濁 |
| 大腸埃希菌 |
標(biāo)示工作能力 |
366nm有瑩光 |
|
| 曙紅亞甲藍(lán)瓊脂 或麥康凱瓊脂 |
大腸埃希菌 |
促生長(zhǎng)發(fā)育工作能力 |
利用率 |
| 乙型肝炎副傷寒沙門(mén)菌 |
利用率 |
||
| 大腸埃希菌 |
標(biāo)示工作能力 |
色調(diào)形狀同對(duì)比 |
|
| 乙型肝炎副傷寒沙門(mén)菌 |
色調(diào)形狀同對(duì)比 |
||
| 乳清蛋白膽鹽發(fā)醇管 |
大腸埃希菌 |
促生長(zhǎng)發(fā)育工作能力 |
混濁脹氣 |
| 橙黃色鏈球菌 |
抑止工作能力 |
末見(jiàn)混濁 |
|
| 乳清蛋白發(fā)醇培養(yǎng)液 |
大腸埃希菌 |
促生長(zhǎng)發(fā)育工作能力 |
混濁 |
| 大腸埃希菌 |
標(biāo)示能力 |
脹氣 |
|
| 營(yíng)養(yǎng)成分骨頭湯 |
乙型肝炎副傷寒沙門(mén)菌 |
促生長(zhǎng)能力 |
混濁 |
| 橙黃色鏈球菌 |
促生長(zhǎng)能力 |
混濁 |
|
| 四硫磺粉酸鈉緩釋片亮綠培養(yǎng)液 |
乙型肝炎副傷寒沙門(mén)菌 |
促生長(zhǎng)能力 |
上清混濁 |
| 橙黃色鏈球菌 |
抑止能力 |
上清末見(jiàn)混濁 |
|
| 膽鹽硫乳瓊脂 或沙門(mén)、志賀屬瓊脂 |
乙型肝炎副傷寒沙門(mén)菌 |
促生長(zhǎng)能力 |
回收率 |
| 乙型肝炎副傷寒沙門(mén)菌 |
標(biāo)示能力 |
顏色形狀同對(duì)比 |
|
| 溴化十六烷基三甲銨 瓊脂 |
銅綠假單胞菌 |
促生長(zhǎng)能力 |
回收率 |
| 大腸埃希菌 |
抑止能力 |
不可生長(zhǎng) |
|
| 綠膿菌素測(cè)量用培養(yǎng)液 |
銅綠假單胞菌 |
促生長(zhǎng)能力 |
回收率 |
| 銅綠假單胞菌 |
標(biāo)示能力 |
顏色形狀同對(duì)比 |
|
| 亞碲磷酸鹽骨頭湯培養(yǎng)液 |
橙黃色鏈球菌 |
促生長(zhǎng)能力 |
混濁 |
| 大腸埃希菌 |
抑止能力 |
末見(jiàn)混濁 |
|
| 卵黃氧化鈉瓊脂或 甘露醇氧化鈉瓊脂 |
橙黃色鏈球菌 |
促生長(zhǎng)能力 |
回收率 |
| 橙黃色鏈球菌 |
標(biāo)示能力 |
顏色形狀同對(duì)比 |
|
| 大腸埃希菌 |
抑止能力 |
不可生長(zhǎng) |
| 培養(yǎng)液 |
檢測(cè)菌種 |
檢測(cè)特點(diǎn) |
檢測(cè)指標(biāo)值 |
| 梭菌增菌培養(yǎng)液 |
生孢梭菌 |
促生長(zhǎng)能力 |
混濁 |
| 澳大利亞瓊脂 |
生孢梭菌 |
促生長(zhǎng)能力 |
回收率 |
| 沙氏葡萄糖水骨頭湯 |
白色念珠菌 |
促生長(zhǎng)能力 |
混濁 |
| 沙氏葡萄糖水瓊脂 |
白色念珠菌 |
促生長(zhǎng)能力 |
回收率 |
| 白色念珠菌 |
標(biāo)示能力 |
顏色形狀同對(duì)比 |
|
| 滴蟲(chóng)著色培養(yǎng)液 |
白色念珠菌 |
促生長(zhǎng)能力 |
回收率 |
| 白色念珠菌 |
標(biāo)示能力 |
顏色形狀同對(duì)比 |
|
| 白色念珠菌 |
抑止能力 |
不可生長(zhǎng) |
|
| 1％聚山梨醋80-苞米 瓊脂塑造物 |
白色念珠菌 |
促生長(zhǎng)能力 |
回收率 |
| 白色念珠菌 |
標(biāo)示能力 |
顏色形狀同對(duì)比 |
4.4 各操縱菌查驗(yàn)用培養(yǎng)液適用范圍查驗(yàn)實(shí)驗(yàn)過(guò)程
操縱菌查驗(yàn)用培養(yǎng)液總數(shù)較多，特性不盡相同。為了更好地防止培養(yǎng)液配置全過(guò)程發(fā)生忽略，這里特別提醒下列好多個(gè)必須獨(dú)特注意到培養(yǎng)液：
不能高壓滅菌只有加溫?zé)_(kāi)殺菌的培養(yǎng)液3種：DHL瓊脂、SS瓊脂和滴蟲(chóng)著色培養(yǎng)液；
必須加上實(shí)驗(yàn)試劑的培養(yǎng)液3種：TTB培養(yǎng)液、亞碲磷酸鹽骨頭湯和澳大利亞瓊脂培養(yǎng)液。
下列描述各培養(yǎng)液適用范圍查驗(yàn)的具體步驟全過(guò)程：
4.4.1 膽鹽乳清蛋白培養(yǎng)液 新鮮配置100ml／瓶的對(duì)比膽鹽乳清蛋白培養(yǎng)液4瓶，121℃殺菌15min。預(yù)留。各自打疫苗大腸埃希菌、銅綠假單胞菌及其橙黃色鏈球菌各1瓶，打疫苗菌液量1ml（不超100cfu），另一瓶不打疫苗菌做為空白試驗(yàn)；被檢培養(yǎng)液同法實(shí)際操作，置要求溫度塑造。塑造18鐘頭，與對(duì)比培養(yǎng)液較為，被檢培養(yǎng)液中實(shí)驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)優(yōu)良，主要表現(xiàn)為液體培養(yǎng)基變混濁；塑造兩天，空缺塑造瓶和打疫苗橙黃色鏈球菌的塑造瓶應(yīng)不可混濁；
4.4.2 MUG培養(yǎng)液新鮮配置5ml／支的對(duì)比MUG培養(yǎng)液，121℃殺菌15min，預(yù)留。取3支，打疫苗大腸埃希菌2支，打疫苗菌液0.2ml（不超100cfu），另一支不打疫苗菌做為空白試驗(yàn)，塑造5鐘頭。在366nm紫外線(xiàn)燈下觀(guān)查結(jié)果；被檢培養(yǎng)液同法實(shí)際操作，置要求溫度塑造?？杖彼茉旃軕?yīng)不可混濁，且366nm處觀(guān)查無(wú)瑩光；與對(duì)比培養(yǎng)液較為，被檢培養(yǎng)液中實(shí)驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)優(yōu)良，主要表現(xiàn)為液體培養(yǎng)基變混濁，366nm處要展現(xiàn)瑩光。若瑩光不顯著，則能延長(zhǎng)至24小時(shí)觀(guān)查。
4.4.3 曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)液（EMB） 新鮮配置對(duì)比EMB瓊脂培養(yǎng)液，121℃殺菌15min，制冷至60℃竭盡平皿，35℃恒溫箱預(yù)培8h儲(chǔ)備用。取五個(gè)無(wú)菌檢測(cè)EMB瓊脂平板電腦，各自施膠打疫苗大腸埃希菌和乙型肝炎副傷寒沙門(mén)菌各2皿，打疫苗菌液0.1ml（含菌50～100cfu），另一平板電腦不打疫苗菌做為空白試驗(yàn)，施膠勻稱(chēng)后于要求溫度顛倒塑造；被檢培養(yǎng)液同法實(shí)際操作。塑造18h，被檢培養(yǎng)液菌體尺寸、形狀特點(diǎn)及顏色應(yīng)與對(duì)比培養(yǎng)液上的菌體一致；塑造24小時(shí)，空缺平板電腦應(yīng)無(wú)菌檢測(cè)落生長(zhǎng)。
4.4.4 麥康凱瓊脂培養(yǎng)液 新鮮配置對(duì)比麥康凱瓊脂培養(yǎng)液，121℃殺菌15min，制冷至60℃竭盡平皿，35℃恒溫箱預(yù)培8h儲(chǔ)備用。取五個(gè)無(wú)菌檢測(cè)麥康凱瓊脂平板電腦，各自施膠打疫苗大腸埃希菌和乙型肝炎副傷寒沙門(mén)菌各5皿，打疫苗菌液0.1ml（含菌50～100cfu），另一平板電腦不打疫苗菌做為空白試驗(yàn)，施膠勻稱(chēng)后于要求溫度顛倒塑造；被檢培養(yǎng)液同法實(shí)際操作。塑造18鐘頭，被檢培養(yǎng)液菌體尺寸、形狀特點(diǎn)及顏色應(yīng)與對(duì)比培養(yǎng)液上的菌體一致；塑造24小時(shí)，空缺平板電腦應(yīng)無(wú)菌檢測(cè)落生長(zhǎng)。
4.4.5 乳清蛋白膽鹽發(fā)醇培養(yǎng)液 新鮮配置十米／支的對(duì)比膽鹽乳清蛋白培養(yǎng)液，121℃殺菌15min，預(yù)留。取5支，各自打疫苗大腸埃希菌和橙黃色鏈球菌，各2支，打疫苗菌液1ml（不超100cfu），另一支不打疫苗菌做為空白試驗(yàn)；被檢培養(yǎng)液同法實(shí)際操作，置要求溫度塑造。塑造18h，與對(duì)比培養(yǎng)液較為，被檢培養(yǎng)液中實(shí)驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)優(yōu)良，主要表現(xiàn)為液體培養(yǎng)基掉色、混濁，且倒管內(nèi)應(yīng)該有顯著的脹氣狀況；塑造24小時(shí)，空缺塑造管和打疫苗橙黃色鏈球菌的塑造管應(yīng)不可掉色、不可混濁。
4.4.6 乳清蛋白發(fā)醇培養(yǎng)液 新鮮配置10ml／支的對(duì)比乳清蛋白發(fā)醇培養(yǎng)液，121℃殺菌15min，預(yù)留。取3支，打疫苗大腸埃希菌2支，打疫苗菌液1ml（不超100cfu），另一支不打疫苗菌做為空白試驗(yàn)；被檢培養(yǎng)液同法實(shí)際操作，置要求溫度塑造。塑造18h，與對(duì)比培養(yǎng)液較為．被檢培養(yǎng)液中實(shí)驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)發(fā)育優(yōu)良，主要表現(xiàn)為液體培養(yǎng)基掉色、混濁，且有軟管中應(yīng)該有顯著的脹氣狀況；塑造24小時(shí)，空缺塑造管應(yīng)不可掉色、不可混濁。
4.4.7 營(yíng)養(yǎng)成分骨頭湯培養(yǎng)液 新鮮配置100ml／瓶的對(duì)比營(yíng)養(yǎng)成分骨頭湯培養(yǎng)液3瓶，121℃殺菌15min，預(yù)留。各自打疫苗乙型肝炎副傷寒沙門(mén)菌和橙黃色鏈球菌各1瓶，打疫苗菌液1ml（不超100cfu），另一瓶不打疫苗菌種做為空白試驗(yàn)；被檢培養(yǎng)液同法實(shí)際操作，置要求溫度塑造。塑造18h，與對(duì)比培養(yǎng)液較為，被檢培養(yǎng)液中實(shí)驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)發(fā)育優(yōu)良，主要表現(xiàn)為液體培養(yǎng)基變混濁；塑造48h，空缺塑造瓶應(yīng)不可混濁。
4.4.8 四硫磺粉酸鈉緩釋片亮綠培養(yǎng)液（TTB） 新鮮配置10ml／支的對(duì)比TTB培養(yǎng)液基本，121℃殺菌15min，預(yù)留。臨用前，無(wú)菌操作原則添加0.2ml碘標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.lml亮綠標(biāo)準(zhǔn)溶液。取5支，各自打疫苗乙型肝炎副傷寒沙門(mén)菌和橙黃色鏈球菌各2支，打疫苗菌液1ml（不超100cfu），另一支不打疫苗菌做為空白試驗(yàn)；被檢培養(yǎng)液同法實(shí)際操作，置要求溫度塑造。塑造18h，與對(duì)比培養(yǎng)液較為，被檢培養(yǎng)液中實(shí)驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)發(fā)育優(yōu)良，主要表現(xiàn)為液體培養(yǎng)基上清混濁；塑造24小時(shí)，空缺的塑造管和打疫苗橙黃色鏈球菌的塑造管應(yīng)不可混濁。
因?yàn)門(mén)TB中的碳酸氫鈣對(duì)混濁狀況觀(guān)查有影響，因而若混濁狀況不顯著，則將各塑造物打疫苗至膽鹽硫乳瓊脂（DHL）或沙門(mén)、志賀屬瓊脂（SS）平板電腦上劃線(xiàn)觀(guān)查T(mén)TB塑造物生長(zhǎng)發(fā)育狀況，空白試驗(yàn)和打疫苗橙黃色鏈球菌的塑造管畫(huà)線(xiàn)后應(yīng)無(wú)菌檢測(cè)落生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)比和被檢TTB培養(yǎng)液畫(huà)線(xiàn)打疫苗至瓊脂平板電腦后應(yīng)該有菌體生長(zhǎng)發(fā)育，且色調(diào)形狀一致。
4.4.9 膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)液（DHL） 新鮮配置對(duì)比DHL瓊脂培養(yǎng)液，加溫充足融解，制冷至60℃竭盡平皿，35℃恒溫箱預(yù)培8h儲(chǔ)備用。取3個(gè)無(wú)菌檢測(cè)DHL瓊脂平板電腦，施膠打疫苗乙型肝炎副傷寒沙門(mén)菌2皿，打疫苗菌液0.1ml（含菌50～100cfu），另一平板電腦不打疫苗菌做為空白試驗(yàn)，施膠勻稱(chēng)后于要求溫度顛倒塑造；被檢培養(yǎng)液同法實(shí)際操作。塑造18h，被檢培養(yǎng)液菌體尺寸、形狀特點(diǎn)及色調(diào)應(yīng)與對(duì)比培養(yǎng)液上的菌體一致；塑造48h，空缺平板電腦應(yīng)無(wú)菌檢測(cè)落生長(zhǎng)發(fā)育。
4.4.10 沙門(mén)、志賀屬瓊脂培養(yǎng)液（SS） 新鮮配置對(duì)比SS瓊脂培養(yǎng)液，加溫充足融解，制冷至60℃竭盡平皿，35℃恒溫箱預(yù)培8h儲(chǔ)備用。取3個(gè)無(wú)菌檢測(cè)SS瓊脂平板電腦，施膠打疫苗乙型肝炎副傷寒沙門(mén)菌2皿，打疫苗菌液0.1ml（含菌50～100cfu），另一平板電腦不打疫苗菌做為空白試驗(yàn)，施膠勻稱(chēng)后于要求溫度顛倒塑造；被檢培養(yǎng)液同法實(shí)際操作。塑造18h，被檢培養(yǎng)液菌體尺寸、形狀特點(diǎn)及色調(diào)應(yīng)與對(duì)比培養(yǎng)液上的菌體一致；塑造48h，空缺平板電腦應(yīng)無(wú)菌檢測(cè)落生長(zhǎng)發(fā)育。
4.4.11 溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)液基本 新鮮配置對(duì)比溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)液，121℃殺菌15min，制冷至60℃竭盡平皿，35℃恒溫箱預(yù)培8h儲(chǔ)備用。取七個(gè)無(wú)菌檢測(cè)瓊脂平板電腦，各自施膠打疫苗銅綠假單胞菌和大腸埃希菌各3皿，打疫苗菌液0.1ml（含菌50～100cfu），另一平板電腦不打疫苗菌做為空白試驗(yàn)，施膠勻稱(chēng)后于要求溫度顛倒塑造；被檢培養(yǎng)液同法實(shí)際操作。塑造18h，被檢培養(yǎng)液菌體尺寸、形狀特點(diǎn)及色調(diào)應(yīng)與對(duì)比培養(yǎng)液上的菌體一致；塑造24小時(shí)，空缺平板電腦和打疫苗大腸埃希菌的平板電腦應(yīng)無(wú)菌檢測(cè)落生長(zhǎng)發(fā)育。
4.4.12 綠膿菌素測(cè)量用培養(yǎng)液（PDP） 新鮮配置對(duì)比綠膿菌素測(cè)量用培養(yǎng)液基本，每升培養(yǎng)液中添加10ml凡士林，121℃殺菌15min，制冷至60℃竭盡平皿，35℃恒溫箱預(yù)培8h儲(chǔ)備用。取3個(gè)無(wú)菌檢測(cè)綠膿菌素測(cè)量用瓊脂平板電腦，施膠打疫苗銅綠假單胞菌2皿，打疫苗菌液0.1ml（含菌50～100cfu），另一平板電腦不打疫苗菌做為空白試驗(yàn)，施膠勻稱(chēng)后于要求溫度顛倒塑造24小時(shí)；被檢培養(yǎng)液同法實(shí)際操作?？杖逼桨咫娔X應(yīng)無(wú)菌檢測(cè)落生長(zhǎng)發(fā)育，被檢培養(yǎng)液菌體尺寸、形狀特點(diǎn)及色調(diào)應(yīng)與對(duì)比培養(yǎng)液上的菌體一致。
4.4.13 亞碲磷酸鹽骨頭湯培養(yǎng)液 新鮮配置100ml／瓶的對(duì)比營(yíng)養(yǎng)成分骨頭湯培養(yǎng)液3瓶，121℃殺菌15min，預(yù)留。臨用添加新鮮配置的無(wú)菌檢測(cè)1％亞碲磷酸鹽0.2ml。各自打疫苗橙黃色鏈球菌和大腸埃希菌各1瓶，打疫苗菌液1ml（不超100cfu），另一瓶不打疫苗菌種做為空白試驗(yàn)；被檢培養(yǎng)液同法實(shí)際操作，置要求溫度塑造。塑造18h，與對(duì)比培養(yǎng)液較為，被檢培養(yǎng)液中實(shí)驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)發(fā)育優(yōu)良，主要表現(xiàn)為液體培養(yǎng)基發(fā)黑、變混濁；塑造48h，空缺塑造瓶和打疫苗大腸埃希菌的塑造瓶應(yīng)不可混濁。
4.4.14 卵黃氧化鈉瓊脂培養(yǎng)液新鮮配置對(duì)比卵黃氧化鈉瓊脂培養(yǎng)液基本，121℃殺菌15min，制冷至60℃，參考2010版《中國(guó)藥典》占比無(wú)菌操作原則添加10％氧化鈉卵黃液，充足振搖后竭盡平皿，35℃恒溫箱預(yù)培8h儲(chǔ)備用。取五個(gè)無(wú)菌檢測(cè)瓊脂平板電腦，各自施膠打疫苗橙黃色鏈球菌和大腸埃希菌各2皿，打疫苗菌液0.1ml（含菌50～100cfu），另一平板電腦不打疫苗菌做為空白試驗(yàn)，施膠勻稱(chēng)后于要求溫度顛倒塑造；被檢培養(yǎng)液同法實(shí)際操作。塑造24小時(shí)，被檢培養(yǎng)液菌體尺寸、形狀特點(diǎn)及色調(diào)應(yīng)與對(duì)比培養(yǎng)液上的菌體一致；塑造72h，空缺平板電腦和打疫苗大腸埃希菌的平板電腦應(yīng)無(wú)菌檢測(cè)落生長(zhǎng)發(fā)育。
4.4.15 甘露醇氧化鈉瓊脂培養(yǎng)液 新鮮配置對(duì)比甘露醇氧化鈉瓊脂培養(yǎng)液，121℃殺菌15min，制冷至60℃竭盡平皿，35℃恒溫箱預(yù)培8h儲(chǔ)備用。取五個(gè)無(wú)菌檢測(cè)瓊脂平板電腦，各自施膠打疫苗橙黃色鏈球菌和大腸埃希菌各2皿，打疫苗菌液0.1ml（含菌50～1000fu），另一平板電腦不打疫苗菌做為空白試驗(yàn)，施膠勻稱(chēng)后于要求溫度顛倒塑造；被檢培養(yǎng)液同法實(shí)際操作。塑造24小時(shí)，被檢培養(yǎng)液菌體尺寸、形狀特點(diǎn)及色調(diào)應(yīng)與對(duì)比培養(yǎng)液上的菌體一致；塑造72h，空缺平板電腦和打疫苗大腸埃希菌的平板電腦應(yīng)無(wú)菌檢測(cè)落生長(zhǎng)發(fā)育。
4.4.16 梭菌增菌培養(yǎng)液 新鮮配置100ml／瓶的對(duì)比梭菌增菌培養(yǎng)液2瓶，121℃殺菌15min，預(yù)留。打疫苗生孢梭菌1瓶，打疫苗菌液1ml（不超100cfu），另一瓶不打疫苗菌種做為空白試驗(yàn)，置要求溫度的厭氧發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)塑造48h；被檢培養(yǎng)液同法實(shí)際操作?？杖彼茉炱繎?yīng)不可混濁；與對(duì)比培養(yǎng)液較為，被檢培養(yǎng)液中實(shí)驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)發(fā)育優(yōu)良，主要表現(xiàn)為液體培養(yǎng)基變混濁。
4.4.17 澳大利亞瓊脂培養(yǎng)液 新鮮配置對(duì)比澳大利亞瓊脂培養(yǎng)液，121℃殺菌15min，制冷至60℃后竭盡平皿，35℃恒溫箱預(yù)培8h儲(chǔ)備用。取3個(gè)澳大利亞瓊脂平板電腦，施膠打疫苗生孢梭菌2皿，打疫苗菌液0.1ml（含菌50～100cfu），另一平板電腦不打疫苗菌做為空白試驗(yàn)，施膠勻稱(chēng)后置攝像頭要求溫度的厭氧發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)下顛倒塑造；被檢培養(yǎng)液同法實(shí)際操作。兩天空缺平板電腦應(yīng)無(wú)菌檢測(cè)落生長(zhǎng)發(fā)育，被檢培養(yǎng)液菌體尺寸、形狀特點(diǎn)應(yīng)與對(duì)比培養(yǎng)液上的菌體一致。
澳大利亞瓊脂培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)豐富，適合大部分需氧菌的生長(zhǎng)發(fā)育，為了更好地清除其他霉菌生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)查驗(yàn)結(jié)果的危害，可在每升殺菌后培養(yǎng)液中按無(wú)菌操作原則加上帶有等同于50mg青霉素的鹽酸青霉素。加上青霉素的澳大利亞瓊脂可參考以上方式開(kāi)展培養(yǎng)液適用范圍調(diào)查。
4.4.18 沙氏葡萄糖水骨頭湯培養(yǎng)液 新鮮配置100ml／瓶的對(duì)比沙氏葡萄糖水骨頭湯培養(yǎng)液2瓶，121℃殺菌15min，預(yù)留。打疫苗白色念珠菌1瓶，打疫苗菌液1ml（不超100cfu），另一瓶不打疫苗菌種做為空白試驗(yàn)；被檢培養(yǎng)液同法實(shí)際操作，置要求溫度塑造。塑造48h，與對(duì)比培養(yǎng)液較為。被檢培養(yǎng)液中實(shí)驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)發(fā)育優(yōu)良，主要表現(xiàn)為液體培養(yǎng)基變混濁；塑造72h，空缺塑造瓶應(yīng)不可混濁。
4.4.19 沙氏葡萄糖水瓊脂培養(yǎng)液 新鮮配置對(duì)比沙氏葡萄糖水瓊脂培養(yǎng)液，121℃殺菌15min，制冷至60℃后，竭盡平皿，35℃恒溫箱預(yù)培8h儲(chǔ)備用。取3個(gè)沙氏葡萄糖水瓊脂平板電腦，施膠打疫苗白色念珠菌2皿，打疫苗菌液0.1ml（含菌50～100cfu），另一平板電腦不打疫苗菌做為空白試驗(yàn)，施膠勻稱(chēng)后于要求溫度顛倒塑造；被檢培養(yǎng)液同法實(shí)際操作。塑造24小時(shí)，被檢培養(yǎng)液上的菌體尺寸、形狀特點(diǎn)、色調(diào)及味道應(yīng)與對(duì)比培養(yǎng)液上的菌體一致；塑造72h，空缺平板電腦應(yīng)無(wú)菌檢測(cè)落生長(zhǎng)發(fā)育。
4.4.20 滴蟲(chóng)著色培養(yǎng)液 新鮮配置對(duì)比滴蟲(chóng)著色培養(yǎng)液，加溫充足融解，制冷至60℃竭盡平皿，35℃恒溫箱預(yù)培8h儲(chǔ)備用。滴蟲(chóng)著色平板電腦應(yīng)用前遮光儲(chǔ)存，取五個(gè)無(wú)菌檢測(cè)滴蟲(chóng)著色平板電腦，各自施膠打疫苗白色念珠菌和大腸埃希菌各2皿，打疫苗0.1ml菌液（含菌50～100cfu），另一平板電腦不打疫苗菌做為空白試驗(yàn)，施膠勻稱(chēng)后于要求溫度顛倒塑造；被檢培養(yǎng)液同法實(shí)際操作。塑造24小時(shí)，被檢培養(yǎng)液上的菌體尺寸、形狀特點(diǎn)及色調(diào)應(yīng)與對(duì)比培養(yǎng)液上的菌體一致；塑造72h，空缺平板電腦和打疫苗大腸埃希菌的平板電腦應(yīng)無(wú)菌檢測(cè)落生長(zhǎng)發(fā)育。
4.4.21 1％聚山梨酯80－苞米瓊脂培養(yǎng)液 新鮮配置對(duì)比1％聚山梨酯80－苞米瓊脂培養(yǎng)液基本，每升培養(yǎng)液中添加10ml聚山梨酯80，121℃殺菌15min，制冷至60℃后，竭盡平皿，35℃恒溫箱預(yù)培8h儲(chǔ)備用。取3個(gè)1％聚山梨酯80－苞米瓊脂平板電腦，施膠打疫苗白色念珠菌2皿，打疫苗菌液0.1ml（含菌50～100cfu），另一平板電腦不打疫苗菌做為空白試驗(yàn)，施膠勻稱(chēng)后于要求溫度顛倒塑造；被檢培養(yǎng)液同法實(shí)際操作。塑造24小時(shí)，被檢培養(yǎng)液菌體的尺寸、形狀特點(diǎn)及芽管標(biāo)示工作能力應(yīng)當(dāng)與對(duì)比培養(yǎng)液上的菌體一致；塑造48h，空缺平板電腦應(yīng)無(wú)菌檢測(cè)落生長(zhǎng)發(fā)育。
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